糖原合成酶激酶3β結構與功能的分子模擬研究.pdf

1、糖原合成酶激酶(Glycogensynthesiskinanse3，GSK3)是一種多功能的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在哺乳動物體內存在兩種高度同源的a和β亞型。GSK3在胰島素、Wnt、Hedgehog、NGF、Reelin以及核因子等多種細胞轉導途徑中扮演著重要角色，對細胞增殖與分化、細胞的凋亡、腫瘤的發(fā)生等方面起著重要的調節(jié)作用。然而當其在體內表達不當時，將導致異常的生理功能，引起一系列如阿爾茨海默病(AD)，癌癥，、躁郁癥、Ⅱ型糖尿病

2、等疾病，已經成為受到廣泛關注的藥物靶點。本論文在已有的實驗基礎上，通過理論計算方法從分子層面上解釋GSK3的結構與功能。
　　 1.在GSK3β中，保守的K85對GSK3β的活性和FRATide的結合非常重要。為了闡明GSK3β活性和FRATide的解離機理，我們對野生型(WT)和K85M突變體的GSK3β-FRATide復合物進行分子動力學模擬、MMGβSA結合自由能計算和簡振模式分析(NMA)。結果表明:在K85M突變體中，

3、Gloop的周期性開合構象變化和RD口袋的緊湊型構象被破壞，導致GSK3β失活。特別地，在K85M突變體中，GSK3β的正確折疊方式被破壞，導致GSK3β殘基K214與FRATide殘基E290和K292形成的兩個氫鍵喪失。而且，MM_GβSA結合自由能計算表明K85M突變體得到能量不利的GSK3β-FRATide復合物。此外，NMA證實GSK3β的N-lobe和C-lobe區(qū)域存在搖擺運動，這些運動會使ATP結合口袋開合，使ATP分子

4、進入ATP結合口袋和ADP分子離開ATP結合口袋。有趣的是，這些現象在K85M突變體中沒有明顯地觀察到。這些研究提供了K85M突變使GSK3β失活和FRATide的解離的結構基礎。
　　 2.與胰島素信號通路相比，Wnt信號通路抑制GSK3β非預磷酸化底物的活性，而不會抑制GSK3β預磷酸化底物的活性。為了更好的了解FRATide抑制GSK3β的選擇性機理，我們使用分子動力學模擬方法和MM_GBSA結合自由能計算方法研究FRAT

5、ide雙突變K214/A-E215/Q對GSK3β的結構影響。研究結果表明:在突變體體系中，預磷酸基團結合口袋、預磷酸底物結合口袋、ATP活性口袋殘基取向以及ATP結合口袋的動力學行為幾乎不受FRATide突變的影響，證明FRATide不會抑制GSK3β對預磷酸化底物的磷酸化。此外，結合自由能計算表明突變體體系得到能量不利的復合物，這會破壞FRATide的結合。
　　 3.蛋白激酶的底物特異性是信號通路完整性和保真度的基本原則。

6、GSK3β對底物有獨特的選擇性。它需要P+4位點處的S/T預先被磷酸化，然后才能磷酸化P0位點處的S/T。GSK3β底物的典型模體為SXXXS(p)，其中，S(p)代表預磷酸化位點。然而，GSK3β底物特異性的預磷酸化機理仍然不清楚。我們使用分子模建和分子動力學(MD)模擬方法來闡明GSK3β底物特異性的P+4預磷酸化機理。首先，我們使用分子模建方法構建一個GSK3β、ATP和磷酸化的糖原合成酶(pGS)的三元復合物(GSK3β/ATP

7、/pGS)。然后，基于這個模型，我們對兩個GSK3β/ATP/pGS和GSK3β/ATP/GS體系進行比較性的12nsMD模擬。與結構分析一致的是，結合自由能計算揭示pGS在預磷酸化狀態(tài)下更有利于結合到GSK3β中。更重要的是，與GSK3β/ATP/GS體系相比，在GSK3β/ATP/pGS體系中，GSK3β的N-端和C-端區(qū)域的正確耦合促使磷酸根轉移反應。而且，在預磷酸化體系中S0-Oγ…Pγ-ATP距離大大地縮短，方便磷酸根轉移反應

8、。
　　 4.GSK3β在調節(jié)許多重要的細胞信號需要兩個Mg2+輔因子的參與。實驗上，Li+是Mg2+的競爭性抑制劑，然而，其它第一主族金屬離子不能取代Mg2+。我們使用兩層基于ONIOM的QM/MM方法和分子動力學(MD)模擬方法研究GSK3β…Mg2ATPM1(M=Mg、Li、Na、K和Rb)復合物來闡明金屬離子取代對激酶活性的影響。ONIOM結果表明:Na+、K+和Rb+與ATP的作用比較弱，使ATP的三磷酸基團發(fā)生大的構

9、象變化，使它們不能有效地與ATP配位。因此，這3種金屬離子在活性口袋內不穩(wěn)定，在MD模擬時會逃離活性口袋，對GSK3β沒有抑制活性。比較GSK3β-Mg2+和GSK3β-Li+體系時，當Li+取代Mg12+時，ATP三磷酸基團的線性磷酸轉移機制、殘基Lys85與ATPβ-和γ-磷酸基團形成的兩個保守氫鍵以及活性口袋的靜電勢都被破壞，這會有效地抑制GSK3β的活性。
　　 5.水分子的重要性在藥物設計方面已經越來越受關注，許多研究

10、表明水分子能夠對配體結合的特異性和親和力有貢獻。我們通過使用兩層基于ONIOM的QM/MM計算、分子動力學模擬以及分子對接方法對蛋白質—抑制劑界面的橋水分子進行研究。ONIOM幾何優(yōu)化和AIM分析證實在氨基酸殘基Thr138和/或Gln185附近存在保守水介導的GSK3β—抑制劑氫鍵網絡作用。對1R0E代表性體系MD模擬證實橋水分子在GSK3β—抑制劑界面活性口袋里是穩(wěn)定的，能夠增加其周圍氨基酸殘基的穩(wěn)定性，也能夠穩(wěn)定GSK3β—抑制劑

11、作用。而且，分子對接研究表明:特別是對于柔性抑制劑，包含橋水分子的對接能夠更好的重現實驗的結合構象。橋水分子能夠提高抑制劑分子的結合自由能。我們的結果表明橋水分子在GSK3β—抑制劑界面起著重要作用。
　　 6.鹵—水—氫橋(halogen-water-hydrogenbridges，XWHbridges)，其中一個水分子介導的常規(guī)氫鍵被鹵鍵取代，是水分子的一種新的作用模式。我們通過兩層基于ONIOM的QM/MM方法計算蛋白質—