糖原合成酶激酶3β在肝功能衰竭的變化與意義.pdf

1、目的：肝功能衰竭是多種因素引起的嚴(yán)重肝臟損害，是臨床常見(jiàn)的嚴(yán)重肝病癥候群，病死率極高。多年來(lái)，各國(guó)學(xué)者對(duì)肝衰竭的發(fā)病機(jī)制不斷進(jìn)行探索，目前尚未完全闡明。糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase3β,GSK3β）為糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase3,GSK3）的亞型。最新研究證實(shí)，GSK3參與炎癥的進(jìn)程，其中GSK3β影響轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)GSK3β在

2、肝衰竭的表達(dá)，探討GSK3β對(duì)肝衰竭病情演變的影響。
　　方法：
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　通過(guò)D-氨基半乳糖（D-Galactosamine，D-GalN）腹腔注射構(gòu)建小鼠急性肝衰竭（Acute liver failure，ALF）模型。檢測(cè)小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine transaminase,ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate transam inase,AST)、總膽紅素(Total bi

3、lirubin,TB)、凝血酶原時(shí)間(Prothrombintime,PT)水平；部分肝組織石蠟包埋后切片，用于蘇木素-伊紅（Hematoxylin-eosin,HE）染色觀察肝臟病理變化；余肝組織經(jīng)液氮速凍后，-80℃冰箱保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-PCR)檢測(cè)肝組織GSK3β mRNA表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肝組織GSK3β、p-GSK3β的表達(dá)及分布，Western

4、 blot檢測(cè)肝組織 GSK3β、p-GSK3β的表達(dá)?！?br>　　2.臨床實(shí)驗(yàn)
　　選取2015年1月至2015年10月河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院門診或
　　住院患者，共47例，其中慢性乙型病毒性肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）患者22例（CHB組）、HBV相關(guān)慢加急性肝功能衰竭（Acute on chronic liver failure,ACLF）患者25例（ACLF組），另外同期于河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)

5、院體檢中心選取20例健康體檢者作為健康對(duì)照(Healthy control)組。除此之外，收集接受肝移植的ACLF患者肝組織12例、肝組織活檢的CHB患者肝組織23例及正常供體肝組織4例。檢測(cè)入組患者血清ALT、AST、TB、DB、INR、HBV DNA水平；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA）檢測(cè)患者血清p-GSK3β、TNFα水平；RT-PCR檢測(cè)肝組織GSK3β mRN

6、A表達(dá)；免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肝組織 GSK3β、p-GSK3β表達(dá)及分布；Western blot檢測(cè)肝組織 GSK3β、p-GSK3β的表達(dá)?！?br>　　結(jié)果：
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分
　　1.1 成功構(gòu)建小鼠肝衰竭模型
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)正常對(duì)照組小鼠毛發(fā)有光澤，精神狀態(tài)好，飲食量多；肝衰竭組小鼠毛發(fā)凌亂沒(méi)有光澤，飲食量、活動(dòng)減少，精神欠佳，反應(yīng)遲鈍。
　　1.2 小鼠血清生化指標(biāo)
　　肝衰竭組小鼠血清

7、ALT、AST、TB、PT水平高于正常對(duì)照組（P均<0.01）。
　　1.3 肝組織病理學(xué)改變
　　正常對(duì)照組：肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，以中央靜脈為軸，肝細(xì)胞索呈放射狀排列，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，大小均勻，無(wú)變性及壞死，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；肝衰竭組：肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞索消失，可見(jiàn)多處出血壞死灶，壞死灶可見(jiàn)細(xì)胞核的碎裂及壞死并有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　1.4 肝組織GSK3βmRNA的表達(dá)
　　肝衰組小鼠肝組織GSK3β mRNA表

8、達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高（P<0.01）。
　　1.5 肝組織GSK3β、p-GSK3β的分布與表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：GSK3β、p-GSK3β主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿。Western blot結(jié)果顯示：正常對(duì)照組、ALF組小鼠肝組織GSK3β表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P>0.05）；ALF組小鼠肝組織p-GSK3β蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　2.臨床實(shí)驗(yàn)部分
　

9、　2.1 各組研究對(duì)象年齡及性別比例具有可比性。ACLF組患者血清ALT、TB、DB、INR水平明顯高于CHB組及健康對(duì)照組（P<0.01）；ACLF組患者Alb則明顯低于CHB組及健康對(duì)照組（P<0.01）；ACLF組和CHB組AST水平、HBV DNA載量無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　2.2 血清TNFα與p-GSK3β水平
　　CHB組血清TNFα水平較正常對(duì)照組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；ACLF組

10、TNFα水平較正常對(duì)照組、CHB組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　CHB組血清p-GSK3β水平較正常對(duì)照組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；ACLF組p-GSK3β水平較正常對(duì)照組、CHB組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　2.3 肝組織GSK3βmRNA的表達(dá)
　　CHB組GSK3βmRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組無(wú)明顯差異（P>0.05）；ACLF組 GSK3β mRNA

11、表達(dá)水平較正常對(duì)照組、CHB組明顯升高（P<0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.4 肝組織GSK3β、p-GSK3β的分布與表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：GSK3β、p-GSK3β主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿。蛋白印跡法結(jié)果顯示：正常對(duì)照組、CHB組、ACLF組患者肝組織GSK3β表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P>0.05）；CHB組p-GSK3β表達(dá)水平較正常對(duì)照組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；ACLF組 p-GSK

12、3β表達(dá)水平較正常對(duì)照組、CHB組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　2.5 ACLF患者血清p-GSK3β與TNFα相關(guān)性分析
　　ACLF患者血清p-GSK3β與TNFα呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=-0.761（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.GSK3β通過(guò)調(diào)節(jié)磷酸化/去磷酸化水平參與了肝衰竭的病理生理過(guò)程。
　　2.HBV相關(guān)ACLF患者GSK3β活性增強(qiáng)，TNFα表達(dá)升高，提示GS