趨化-捕獲內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)移植脂肪血管化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：自體脂肪移植已有近百年歷史。但因?yàn)橛坞x脂肪細(xì)胞移植早期未建立有效血供而導(dǎo)致移植脂肪大量壞死。如何能有效促進(jìn)移植脂肪血管化進(jìn)而提高其成活率成為整形外科醫(yī)生困擾已久的問題。近些年各種研究大部分集中在添加各種細(xì)胞因子，通過調(diào)控血管生長因子達(dá)到促進(jìn)血管化的目的。然而參與新血管形成并非單一的調(diào)控環(huán)節(jié)，需要多種細(xì)胞因子及相關(guān)細(xì)胞共同參與、相互作用。CAL技術(shù)即在游離脂肪細(xì)胞移植技術(shù)中添加ADSCs，ADSCs可分泌多種細(xì)胞因子及生長因子，在一

2、定程度上提高了移植脂肪成活率，但距離理想的高成活率仍具有一定差距。目前EPC作為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，參與血管的生理性及病理性形成。然而生理狀態(tài)下外周血EPC數(shù)量極少。體外既使能培養(yǎng)、擴(kuò)增足量的EPC，但長時(shí)間培養(yǎng)后容易導(dǎo)致干細(xì)胞分化而失去血管生成能力。大量研究表明，EPC可被基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1a（SDF-1a/CXCL12）趨化，通過SDF-1a與CXCR4受體結(jié)合激活傳導(dǎo)通路，迅速動(dòng)歸巢到局部作為主要細(xì)胞成分參與血管新生及血管內(nèi)皮修復(fù)

3、。目前國內(nèi)外有應(yīng)用SDF-1a作為趨化劑趨化EPC促進(jìn)血管修復(fù)及再通的研究，但尚未見通過應(yīng)用SDF-1a修飾的脂肪干細(xì)胞體內(nèi)定向趨化EPC促進(jìn)移植脂肪血管重建的研究。
　　目的：1、脂肪干細(xì)胞獲取、鑒定及細(xì)胞生長特性研究。2、CXCL12慢病毒載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞的可行性研究及目的蛋白的表達(dá)檢查。3、過表達(dá)目的蛋白CXCL12的脂肪干細(xì)胞在體內(nèi)對EPC的趨化-捕獲作用。4、趨化-捕獲的EPC對移植脂肪組織的成血管作用及對移植

4、脂肪成活率的影響。
　　材料與方法：1.ADSCs的分離培養(yǎng)及鑒定：取臨床吸脂術(shù)抽吸脂肪，離心過濾后獲取原代ADSCs培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原及成脂、成骨誘導(dǎo)分化進(jìn)行鑒定。2.CXCL12慢病毒載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染ADSCs并檢測目的蛋白的表達(dá)：PCR法與慢病毒系統(tǒng)包裝病毒并轉(zhuǎn)染ADSCs，Western-blot檢測ADSCs目的蛋白的表達(dá)。3.脂肪移植模型的制備及分組：將A、B、C、D四組移植物隨機(jī)注入裸鼠背部皮下：A組為C

5、XCL12轉(zhuǎn)染的ADSCs與脂肪組織混合物;B組為慢病毒空載體轉(zhuǎn)染的ADSCs與脂肪混合物;C組為正常ADSCs與脂肪混合物;D組為培養(yǎng)基與脂肪混合物。4.EPC的趨化-捕獲情況觀察：術(shù)后第2、4、7、14、30天，測外周血EPC數(shù)量;western-blot法檢測移植物目的蛋白表達(dá)情況。5.移植物成血管情況觀察及對移植脂肪成活率的影響觀察：第2、4、7、14、30天免疫組化切片成血管形成情況的觀察：(1)各組各時(shí)間段新生成血管計(jì)數(shù);(

6、2)90天組移植物濕重測量;(3)90天移植物“點(diǎn)計(jì)數(shù)”液化壞死及纖維化程度。6.統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：1.分離培養(yǎng)的ADSCs形態(tài)、成脂、成骨誘導(dǎo)，及流式細(xì)胞儀檢測均符合脂肪干細(xì)胞特性。2.構(gòu)建的目的基因載體成功轉(zhuǎn)染ADSCs，篩選后擴(kuò)增細(xì)胞，檢測到轉(zhuǎn)染后的ADSCs高表達(dá)目的蛋白SDF-1a。3.第2、4、7、14、30天檢測外周血單核細(xì)胞EPC明顯高于B、C、D組;移植組織目的蛋白表達(dá)明顯高于B、C、D組。4.A組脂肪移植物

7、血管形成早于其他組，且血管形成數(shù)量多于其他組;5.移植物90天稱重A組平均濕重最大;組織病理切片顯示A組脂肪組織存活最多。
　　結(jié)論：1.ADSCs來源豐富，提取方法成熟、操作簡單，細(xì)胞具有多向分化能力，并可以分泌多種細(xì)胞因子，適合基因轉(zhuǎn)染，作為目的基因載體具有優(yōu)勢。2.目前慢病毒載體構(gòu)建技術(shù)成熟、高校，構(gòu)建的過表達(dá)SDF-1a的ADSCs在裸鼠體內(nèi)可長期穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白。3.在體內(nèi)ADSCs表達(dá)的SDF-1a快速動(dòng)員骨髓內(nèi)的EP