微囊化VEGF基因修飾細胞移植促進脫細胞真皮血管化的研究.pdf

1、皮膚缺損創(chuàng)面的修復一直是外科領(lǐng)域不斷深入研究的課題,而理想的創(chuàng)面愈合應含有真皮層結(jié)構(gòu)。目前已研究證實異種脫細胞真皮是較理想的真皮替代物,異種脫細胞真皮基質(zhì)與自體薄皮片復合移植修復皮膚缺損創(chuàng)面在國內(nèi)外已有報道。異種脫細胞真皮的來源廣,成本低,有望在臨床上廣泛應用。但不具備血管結(jié)構(gòu)的脫細胞真皮層血管化速度慢,這是導致其上方表皮細胞營養(yǎng)缺乏、局部感染和移植失敗的主要原因。因而促進脫細胞真皮移植后的早期血管化是移植成功的關(guān)鍵。 在目前實

2、驗研究中,為了提高移植皮片的存活能力,許多能誘導新生血管形成的生長因子應用于移植皮片的研究。其中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)是作用最強、特異性最高的因子,其促進血管生成作用已得到認可。但VEGF蛋白質(zhì)的半衰期較短,限制了臨床應用。目前尚無一個完善的釋放傳遞系統(tǒng)以延長VEGF與組織的接觸時間(即作用時間),讓其發(fā)揮最大的生物效應。VEGF基因治療可克服單純蛋白質(zhì)治療的缺點

3、,因此人們考慮應用VEGF基因治療。實踐中遇到的問題是導入的基因難以在體內(nèi)持續(xù)表達；有些難以獲得有效基因轉(zhuǎn)移；而且還存在安全性問題；體外細胞增殖困難,自體細胞來源少及再移植后存活率低等。1993年加拿大的Sun和Chang最早提出了異體體細胞基因治療的策略,即將目的基因?qū)胍呀⒌募毎祪?nèi),使其表達基因產(chǎn)物,再將其移入病人體內(nèi)。這樣大大擴展了細胞來源,但是免疫排斥反應又限制了其應用。微囊化細胞移植技術(shù)為解決這一問題提供了新方法,異體或異

4、種細胞微囊后移植可避免宿主的免疫排斥反應,同時可發(fā)揮分泌等功能。 20世紀80年代初,微囊化技術(shù)與組織細胞移植相結(jié)合,其特點在于選擇性透過膜,可避免免疫系統(tǒng)對囊內(nèi)細胞的攻擊,起到免疫隔離作用,而小分子的營養(yǎng)物質(zhì)和囊內(nèi)生物活性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物可自由出入。之后,微囊化細胞技術(shù)廣泛應用于神經(jīng)內(nèi)分泌疾病的基礎(chǔ)和臨床研究,并已取得可喜成績。至90年代,隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展,人們嘗試以微囊作為轉(zhuǎn)基因細胞的免疫隔離和運載工具,利用基因修飾的異

5、體或異種細胞的代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機體生理功能,治療相關(guān)疾病。 微囊化基因工程細胞技術(shù)是將微囊化技術(shù)與基因工程細胞技術(shù)的有機結(jié)合,使基因工程細胞即基因修飾細胞借助微囊的免疫隔離作用在受體體內(nèi)長期存活,并持續(xù)表達目的蛋白,有助于克服傳統(tǒng)基因工程藥物半衰期短,活性不高等缺點,相對于基因治療則具有不改變受體基因組,更加安全,且可以批量生產(chǎn),凍存后隨時移植給所需患者,有降低工作量與成本的優(yōu)點。所以理論上將微囊化技術(shù)與基因工程技術(shù)及組織移植技術(shù)相

6、結(jié)合,通過轉(zhuǎn)VEGF基因的方式使囊內(nèi)細胞具有分泌VEGF的功能,可促進移植組織血管化。然而,微囊化VEGF基因修飾細胞能否在創(chuàng)面異種真皮移植中起到加快早期血管化作用,目前國內(nèi)外未見相關(guān)報道。為此本文設(shè)計了本課題實驗,進行了以下四個部分的實驗研究。 第一部分:hVEGF165基因重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定 目的：構(gòu)建攜帶人血管內(nèi)皮生長因子-165(hVEGF165)基因的重組腺病毒載體(Ad.VEGF),為后續(xù)基因轉(zhuǎn)染、微囊化

7、基因修飾細胞制備等研究提供實驗基礎(chǔ)。 方法：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將pAxCAwt.hVEGF165與DNA-TPC共轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞,擴增后獲得載hVEGF165基因的復制缺陷型重組腺病毒。使用PCR、酶切證實重組腺病毒中的目的基因。并根據(jù)半數(shù)組織感染量(TCID50)法計算病毒滴度。 結(jié)果：采用脂質(zhì)體法可使pAxCAwt.VEGF165與DNA-TPC有效轉(zhuǎn)染293細胞,擴增出載hVEGF165基因的復制缺陷型重組腺

8、病毒。PCR的產(chǎn)物進行NcoI酶切鑒定,可得到597bp、146bp兩個片段,與GeneTool軟件理論上計算的結(jié)果完全一致。計算病毒滴度為2.2×1012pfu/ml。 結(jié)論：成功構(gòu)建復制缺陷型重組腺病毒Ad.VEGF165,其滴度高,毒性低,效率高,體外轉(zhuǎn)染安全。 第二部分：腺病毒介導hVEGF165基因體外感染NIH3T3細胞 目的：探討腺病毒介導人血管內(nèi)皮細胞生長因子(hVEGF165)基因轉(zhuǎn)染NIH3T

9、3細胞后目的基因表達情況及對NIH3T3細胞增殖分化的影響。 方法：應用Ad.VEGF感染傳代培養(yǎng)的NIH3T3細胞后,用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效果和轉(zhuǎn)染率,免疫組化、RT-PCR和EIASA方法分別檢測hVEGF165基因轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞后VEGF的表達情況,MTT檢測細胞增值活性。 結(jié)果：腺病毒介導的hVEGF165基因?qū)τ贜IH3T3細胞具有較高的轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染效率與病毒感染復制數(shù)(multiplidt

10、ies ofinfection,MOI)具有量效關(guān)系。MOI為100倍時,轉(zhuǎn)染效率達95％,轉(zhuǎn)染VEGF后,RT-PCR、免疫組化顯示NIH3T3細胞可有效表達VEGF,ELISA示7d時表達達到高峰(1052 pg/mL),13d后仍可檢測到VEGF的表達。兩周內(nèi)采用MTT動態(tài)檢測OD值,轉(zhuǎn)染組細胞與未轉(zhuǎn)染組細胞相比無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論：腺病毒介導的hVEGF165基因可以有效的轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞,NIH3T

11、3細胞是一種較理想的基因載體細胞,其攜帶的VEGF基因可獲得較高的表達水平。 第三部分：微囊化VEGF基因修飾NIH3T3細胞的制備及體外培養(yǎng) 目的：制備微囊化VEGF基因修飾NIH3T3細胞,并研究微囊化技術(shù)對VEGF基因修飾NIH3T3細胞增殖與活性及代謝分泌功能的影響。 方法：應用純化海藻酸鈉.氯化鋇技術(shù)制備微囊化VEGF基因修飾NIH3T3細胞,并與未微囊化細胞對照培養(yǎng),在倒置相差顯微鏡下觀察微囊及細胞形

12、態(tài),用MTT和PI染色流式細胞術(shù)檢測細胞的增殖及活性情況,并每48h更換和收集微囊化和未微囊化基因修飾NIH3T3細胞培養(yǎng)液,-20℃保存,通過ELISA檢測培養(yǎng)液VEGF的含量,兩組進行對比分析。 結(jié)果：微囊形態(tài)較圓整,細胞生長良好,兩組細胞增殖與活性及培養(yǎng)液中VEGF的含量的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 結(jié)論：微囊化并不影響基因修飾細胞的生長代謝功能,與對照組比較,在體外培養(yǎng)時生物學特性無明顯差異,從而為研究微

13、囊化基因修飾細胞體內(nèi)移植打下實驗基礎(chǔ)。 第四部分：微囊化VEGF基因修飾細胞移植促進脫細胞真皮血管化 目的：探討微囊化VEGF基因修飾NIH3T3細胞移植對豬脫細胞真皮早期血管化及其復合皮存活的影響,從而探討其應用于創(chuàng)面促進豬脫細胞真皮血管化的可行性。 方法：以豚鼠背部急性皮膚全層缺損創(chuàng)面為模型,且對稱性分為4個區(qū),按移植物不同分為四組：微囊化VEGF-NIH3T3+復合皮移植組(A組)、未微囊化VEGF-NIH

14、3T3+復合皮移植組(B組)、空囊+復合皮移植組(C組)、PBS空白對照+復合皮移植組(D組)。觀察移植一周后微囊化細胞及未微囊化細胞在組織中病理形態(tài)改變；一周后ADM微血管化程度和兩周后復合皮的存活率；術(shù)后3,7,14天取脫細胞真皮組織,采用免疫組化SP法檢測hVEGF與CD34的表達,并計算微血管密度(microvessel density,MVD),進行統(tǒng)計學分析。 結(jié)果：微囊化基因修飾細胞移植一周后微囊形態(tài)較好,細胞有增

15、值現(xiàn)象,囊周圍無明顯淋巴細胞浸潤,而未微囊化基因修飾細胞周圍有明顯淋巴細胞浸潤。一周后大體解剖及病理切片顯示,A組血管化程度明顯強于B組。兩周后A組皮片存活率(91±7％)明顯高于其他三組(B,C,D組分別為79±5％,76±2％,77±4％)(P<0.01),B、C、D三組之間無明顯差異(P>0.05)。移植后的3,7,14天A組hVEGF及CD34表達明顯強于其他三組,且7,14天MVD明顯高于其他三組(P<0.01),而其他三組之

16、間無明顯區(qū)別(P>0.05)。 結(jié)論：微囊化基因修飾細胞移植可促進創(chuàng)面異種脫細胞真皮早期血管化,提高復合皮片存活率,改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量。 綜上所述,本研究初步證實了微囊化基因修飾細胞制備的可行性,在體外培養(yǎng)微囊內(nèi)細胞增值活性好,VEGF穩(wěn)定表達。體內(nèi)植入可促進創(chuàng)面脫細胞真皮早期快速血管化,改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量。可以期待,隨著微囊化和基因工程技術(shù)的不斷深入研究,必將產(chǎn)生一系列成果,為組織移植及難愈創(chuàng)面的血管化提供新的臨床治療策略