CAFs通過(guò)IL-6-STAT3通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及增強(qiáng)紫杉醇耐藥性的研究.pdf

1、目的:上皮性卵巢癌在女性常見(jiàn)生殖道腫瘤中位居第三，死亡率卻屆首位。紫杉醇聯(lián)合鉑類(lèi)為卵巢癌一線化療方案。約20％的患者在初次化療時(shí)即司出現(xiàn)耐藥。一線化療緩解后約80％的患者在2年內(nèi)復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)后容易產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致化療失敗，5年生存率僅約30％-40％。如何抑制卵巢癌紫杉醇化療耐藥是改善晚期卵巢癌預(yù)后的至關(guān)重要的問(wèn)題。腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)、血管和多種炎性/免疫細(xì)胞組成的有利于腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移的炎性微環(huán)境。其中，

2、成纖維細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中間質(zhì)細(xì)胞的主要組成部分，也被稱(chēng)為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)。它是腫瘤間質(zhì)中被活化的成纖維細(xì)胞，表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，有肌纖維母細(xì)胞的特質(zhì)。CAFs可以通過(guò)自分泌及旁分泌產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)自身及癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。近期研究發(fā)現(xiàn)CAFs高表達(dá)炎性因子IL-6、COX-2和CXCL1，并可釋放HIF-1α作用于VEGF-A，調(diào)控?zé)o氧條件下腫瘤血管生成。此外有研究報(bào)道CAFs與頭頸鱗癌細(xì)胞共培養(yǎng)，可上調(diào)

3、癌細(xì)胞和CAFs中的表達(dá)，進(jìn)而降低頭頸鱗癌對(duì)西妥昔單抗治療的敏感性。腫瘤相關(guān)脂肪細(xì)胞和CAFs可通過(guò)外泌體傳遞miR21，作用于卵巢癌細(xì)胞凋亡酶激活因子(APAF1)，抑制凋亡并增強(qiáng)紫杉醇耐藥性。這些研究提示CAFs可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的敏感性，有可能成為改善腫瘤治療療效及逆轉(zhuǎn)耐藥的靶點(diǎn)。白介素6(interleukin-6，IL-6)是一種重要的炎性因子，它和細(xì)胞膜上的細(xì)胞因子IL-6R結(jié)合后，可激活JAK2/STAT3通路和P13

4、K/AKT等通路。JAK2/STAT3通路是一條從膜到核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，JAK2蛋白激酶活化后，催化STAT3蛋白磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)控EMT相關(guān)基因等基因表達(dá)。目前研究發(fā)現(xiàn)IL-6/JAK2/STAT3通路過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮性-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)。近期Nature雜志上兩項(xiàng)研究提出EMT與化療耐藥密切相關(guān);其機(jī)制可能是EMT可誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖能力下調(diào)，抑制細(xì)

5、胞凋亡，并增強(qiáng)耐藥基因的表達(dá)。本文擬探討:CAFs來(lái)源的IL-6通過(guò)JAK2/STAT3通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞EMT及紫杉醇化療敏感性的影響。研究可進(jìn)步闡明腫瘤微環(huán)境中CAFs對(duì)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)作用，期待為紫杉醇耐藥患者的靶向治療提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、我們從卵巢癌新鮮組織中分離培養(yǎng)原代癌細(xì)胞、CAFs和正常成纖維細(xì)胞(normalfibroblasts，NFs)，通過(guò)細(xì)胞爬片免疫熒光實(shí)驗(yàn)、組織免疫組化染色、

6、RT-PCR及Elisa法，定位并驗(yàn)證IL6在卵巢癌病人組織中的表達(dá)。
　　2、取CAFs和NFs的上清液作用于OVCAR3細(xì)胞，檢測(cè)其增殖及侵襲能力和EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，并檢測(cè)磷酸化JAK2蛋白及STAT3蛋白的表達(dá)。
　　3、分別采用JAK2/STAT3通路特異性抑制劑AG490和β-TGF抑制劑抑制癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化后，檢測(cè)癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和紫杉醇作用后的凋亡變化。
　　卵巢癌組織中IL-6表達(dá)與化療敏感性

7、的關(guān)系:入組2009.1.1至2014.6.30于山東省腫瘤防治研究院婦科行手術(shù)治療的卵巢癌患者。入組標(biāo)準(zhǔn):1）初治并經(jīng)術(shù)后病理確診的病例;2）II-IV期中晚期患者，行卵巢癌細(xì)胞減滅術(shù)（手術(shù)方式為全子宮+雙附件+大網(wǎng)膜+闌尾切除+盆腹腔腫物切除術(shù)）;3）有詳細(xì)的臨床病理資料及隨訪資料;4）術(shù)前及術(shù)后接受紫杉醇聯(lián)合卡鉑或順鉑的聯(lián)合化療。隨訪:隨訪自確診之日起，采用病歷跟蹤、電話隨訪結(jié)合患者返院門(mén)診復(fù)查情況隨訪，并截止至2016-06-3

8、0。切片結(jié)果分析:陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞間質(zhì)成纖維細(xì)胞胞質(zhì)及胞核黃染。陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞間質(zhì)成纖維細(xì)胞胞質(zhì)及胞核黃染。兩位觀察者根據(jù)間質(zhì)IL-6的表達(dá)來(lái)判定結(jié)果。評(píng)估5個(gè)視野，不考慮染色強(qiáng)度，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞的比例。IL-6表達(dá)分為兩個(gè)等級(jí):高表達(dá)組，至少50％間質(zhì)成纖維細(xì)胞陽(yáng)性;低表達(dá)組，間質(zhì)細(xì)胞核陽(yáng)性不足50％。統(tǒng)計(jì)分析:所有的統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行。腫瘤間質(zhì)中IL-6的表達(dá)與化療后復(fù)發(fā)問(wèn)隔的關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)。腫瘤間質(zhì)中IL-6的表

9、達(dá)及其他臨床病例特點(diǎn)與化療后復(fù)發(fā)間隔之間的關(guān)系采用一元線性回歸及多元線性回歸檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1、分離純化CAFs和NFs后，行細(xì)胞爬片，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法鑒定成纖維細(xì)胞標(biāo)志Vimentin和CAFs活化標(biāo)志α-SMA的表達(dá)。發(fā)現(xiàn):CAFs和NFs均表達(dá)Vimentin，但是與CAFs中高表達(dá)的α-SMA相比，NFs中α-SMA幾乎不表達(dá)。a，進(jìn)一步檢測(cè)CAFs和NFs中IL-6的表達(dá)，發(fā)現(xiàn):表達(dá)活性標(biāo)志α-SMA

10、的CAFs細(xì)胞同樣高表達(dá)IL-6，α-SMA和IL-6在CAFs細(xì)胞中共定位;相反的是，有微弱α-SMA表達(dá)的NFs，IL-6表達(dá)同樣微弱。b，同樣地，在卵巢上皮癌組織切的IHC染色中，同樣發(fā)現(xiàn)IL-6主要表達(dá)于卵巢癌間質(zhì)細(xì)胞中，與間質(zhì)CAFs細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)共定位。提示CAFs是卵巢癌組織中IL-6的主要來(lái)源。c，抽提細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)效果。發(fā)現(xiàn):CAFs中IL-6mRNA的表達(dá)明顯高于NFs、原代癌細(xì)

11、胞及OVCAR3。d，應(yīng)用Elisa的方法檢測(cè)了CAFs、NFs、原代癌細(xì)胞和OVCAR3細(xì)胞上清中IL-6的表達(dá)，發(fā)現(xiàn):CAFs中IL-6的表達(dá)明顯高于NFs、原代癌細(xì)胞及OVCAR3。提示CAFs是卵巢癌病人組織中IL-6表達(dá)的主要來(lái)源。
　　2、取CAFs及NFs的上清液作用于OVCAR3細(xì)胞，a，CCk8增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)來(lái)源于CAFs的上清可以顯著刺激OVCAR3細(xì)胞的增殖;b，同樣地，CAFs上清處理后的OVCAR3細(xì)胞侵襲

12、能力明顯高于NFs上清處理組。但是，加入IL-6的抗體后，CAFs上清對(duì)OVCAR3細(xì)胞增殖和侵襲的促進(jìn)作用明顯減弱。提示:CAFs來(lái)源的IL-6可能是促進(jìn)OVCAR3細(xì)胞增殖和侵襲的重要因子。
　　我們進(jìn)一步檢測(cè)了CAFs及NFs的上清處理后OVCAR3細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白，發(fā)現(xiàn):CAFs上清處理后OVCAR3細(xì)胞間質(zhì)性標(biāo)志物N-Cadherin、Vimentin明顯升高，而上皮性標(biāo)志物E-caderin表達(dá)下調(diào)，提示了癌

13、細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化增強(qiáng)。而加入IL-6的抗體后，CAFs上清對(duì)OVCAR3細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志表達(dá)的調(diào)控作用明顯減弱。NFs上清處理后OVCAR3細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志無(wú)明顯變化。提示CAFs來(lái)源的IL-6促進(jìn)了OVCAR3細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)變。
　　將CAFs及NFs的上清液作用于OVCAR3細(xì)胞，結(jié)果顯示CAFs上清處理組OVCAR3細(xì)胞JAK2蛋白及STAT3蛋白的磷酸化水平明顯高于NFs處理組，而加入IL-6抗體后JAK2

14、及STAT3蛋白磷酸化水平下降。CAFs的上清液處理OVCAR3細(xì)胞，同時(shí)加入JAK2/STAT3信號(hào)通路特異性阻斷劑AG490，STAT3蛋白的磷酸化受抑制，OVCAR3細(xì)胞的上皮性標(biāo)志物表達(dá)明顯升高，而問(wèn)質(zhì)性標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)。提示CAFs來(lái)源的IL-6可能通過(guò)JAK2/STAT3介導(dǎo)了OVCAR3細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)變。
　　3、CAFs及NFs上清液孵育OVCAR3細(xì)胞24h后，加入紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的

15、凋亡情況，發(fā)現(xiàn):CAFs上清處理后的OVCAR3細(xì)胞凋亡細(xì)胞減少;而加入IL-6中和抗體后，可以減弱紫杉醇的抵抗，促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步應(yīng)用WB檢測(cè)OVCAR3細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn):與NFs上清處理組相比，CAFs上清處理組促凋亡蛋白表達(dá)減弱，凋亡抑制蛋白表達(dá)增強(qiáng)。提示CAFs來(lái)源的IL6參與了OVCAR3細(xì)胞的紫杉醇抵抗。
　　將上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)因子β-TGF的抑制劑SB431542加入培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)CAFs

16、上清培養(yǎng)的OVCAR3細(xì)胞上皮性標(biāo)志物表達(dá)明顯升高，而間質(zhì)性標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，而且在紫杉醇的作用下凋亡細(xì)胞的數(shù)量增多。提示CAFs來(lái)源的IL-6誘導(dǎo)的卵巢癌紫杉醇抵抗可能與細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。
　　卡方檢驗(yàn)及Fisher精確檢驗(yàn)顯示:卵巢癌間質(zhì)中IL-6表達(dá)與病理類(lèi)型(P=0.014)及CA125(P＜0.001)密切相關(guān)，而與年齡、病理分級(jí)、FIGO分期、新輔助化療和細(xì)胞減滅術(shù)滿意度無(wú)相關(guān)(P＞0.05)。
　　共收集

17、2009.1.1-2014.6.30于山東省腫瘤防治研究院婦科行手術(shù)治療的卵巢癌患者255例。免疫組化染色顯示:IL-6蛋白主要表達(dá)于問(wèn)質(zhì)，在耐藥性卵巢癌巾表達(dá)顯著升高，與卵巢癌的紫杉醇化療敏感性密切相關(guān)。按接受TP方案化療方案6個(gè)月內(nèi)有無(wú)復(fù)發(fā)分為化療敏感組(n=160)及化療耐藥組（n=95）。并按間質(zhì)中IL-6蛋白染色情況分為低表達(dá)組(n=176)及高表達(dá)組(n=79)，顯示:IL-6蛋白低表達(dá)組化療敏感率為69.3％，高表達(dá)組化療

18、敏感率為48.1％，兩者存在顯著差異(P=0.01)。
　　結(jié)論:CAFs中IL-6表達(dá)顯著高于NFs及卵巢癌細(xì)胞，CAFs是卵巢癌腫瘤微環(huán)境中IL-6表達(dá)的主要來(lái)源;CAFs分泌的IL-6因子可促進(jìn)卵巢癌癌細(xì)胞JAK2蛋白磷酸化及STAT3蛋白磷酸化加強(qiáng)，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖增強(qiáng)，并誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng);CAFs通過(guò)IL-6/STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化后，可能導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡抵抗，導(dǎo)致癌細(xì)