VKORC1和CYP4F2基因多態(tài)性作用于維生素K1及對華法林對映異構體濃度和藥效學指標影響的研究.pdf

1、目的：華法林（Warfarin，WF）是目前應用廣泛的口服抗凝血藥，由于WF的有效治療范圍狹窄，個體間劑量差異大，有效劑量不易控制，故臨床主要以凝血酶原時間(prothrombin time，PT)和國際標準化比率(international normalized ratio，INR)作為其抗凝監(jiān)測指標。WF用藥劑量受很多因素的影響，包括：維生素K的攝入、種族、年齡、合并用藥、體重指數(shù)以及遺傳基因等方面的因素。本研究通過分析遺傳基因（V

2、KORC1和CYP4F2）和維生素K1（VitaminK1，VK1）對WF的劑量反應的作用、血漿中VK1濃度和CYP4F2基因多態(tài)性以及與VKORC1的相關性，嘗試揭示體內VK1的濃度與WF敏感指數(shù)的關系，為今后WF在臨床上的個體化給藥提供參考，以期達到提高抗凝控制率、減少出血風險、增強臨床醫(yī)生使用WF治療信心的目的。
　　方法：血漿VK1的HPLC-MS/MS檢測方法：采用APCI源正離子模式，穩(wěn)定性同位素標記物(Vitamin

3、K1-d7)為內標定量， VK1和內標的檢測離子對質荷比分別為m/z：451.0→187.0和458.6→194.4，乙醇沉淀蛋白，環(huán)己烷為萃取劑進行液液萃取，使用Synergl4u Fusion-RP C18（2.1mm×100mm，2.5μm）進行色譜分離，流動相為A：B=水（0.05％甲酸）：甲醇，梯度洗脫程序，流速0.3mL/min；血漿WF對映異構體的HPLC-MS/MS檢測方法：采用ESI源負離子模式，萘普生為內標定量，WF

4、和內標的檢測離子對質荷比分別為m/z：307.2→160.9和228.9→185.1，1mol/L鹽酸作為緩沖環(huán)境，乙酸乙酯液液萃取。通過Lux Cellulose-3手性色譜柱（2.1mm×100mm，2μm）分離WF對映異構體和內標，A：B=水(0.5%甲酸)：甲醇，流速：0.2mL/min；臨床樣本的收集、采集以及檢測：收集南京東南大學附屬醫(yī)院正常使用WF達到穩(wěn)定劑量的房顫患者21例作為觀察組，選擇同期健康受試者55例作為對照組，

5、統(tǒng)一給予實驗標準餐?；颊呒{入標準：①患者穩(wěn)定抗凝至少3個月（抗凝水平在治療窗以內）；②抽血前一個月有穩(wěn)定的日常WF劑量。排除標準：有和胺碘酮以及抗癌藥聯(lián)合應用的。WF抗凝治療方案：初始劑量1~3mg，根據(jù)INR調整劑量。觀察組實驗清晨空腹抽取WF給藥前谷濃度外周血9.0mL，對照組空腹抽取外周血5.0mL。分別檢測每位患者血漿中VK1以及WF對映異構體濃度、凝血因子水平、PT/INR、VKORC1、CYP4F2、CYP2C9基因型；檢測

6、每位健康受試者血漿中VK1和 VKORC1、CYP4F2基因型。根據(jù)所測得VK1和WF對映異構體濃度，結合VKORC1和CYP4F2基因型和凝血因子水平、PT-INR，采用Origin統(tǒng)計學軟件對基因多態(tài)性和VK1與WF對映異構體濃度和藥效學指數(shù)進行相關性分析。
　　結果：研究建立的檢測血漿中VK1和WF對映異構體濃度的HPLC-MS/MS測定方法通過方法學考察，證明準確、可靠。由于樣品量有限和WF個體差異大等因素，研究中雖未發(fā)現(xiàn)

7、患者血漿中VK1濃度和WF敏感指數(shù)顯著性相關，但在中國部分漢族人群中證明了VKORC1和CYP4F2基因多態(tài)性顯著地影響血漿中VK1濃度。研究結果發(fā)現(xiàn)攜帶VKORC1G/A基因型的患者VK1濃度顯著性的高于攜帶A/A基因型的患者（p<0.05）；攜帶CYP4F2C/T和T/T基因型的患者VK1濃度顯著性的高于攜帶C/C基因型的患者（p<0.05）。而健康受試者中，VKORC1基因多態(tài)性和VK1的濃度的相關性不顯著，但CYP4F2（T/T

8、+C/T）基因型的VK1濃度顯著高于C/C基因型（p<0.05）。結合文獻提示臨床醫(yī)生在 WF的治療過程中，攜帶VKORC1G/G+CYP4F2T/T基因型的患者有較寬的WF治療窗，相對安全；攜帶VKORC1G/A+CYP4F2C/T基因型的患者使用WF時要監(jiān)測INR，不斷調整WF個體用藥，以達到安全用藥的目的；值得注意的是攜帶VKORC1A/A+CYP4F2C/C基因型的患者對WF劑量特別敏感，臨床中不僅要實時檢測INR；還需要通過調

9、整飲食，嚴格控制VK1的攝入量；必要時換用新型口服抗凝藥保證患者的用藥安全。
　　結論：建立的HPLC-MS/MS測定血漿中VK1和WF對映異構體濃度的方法已成功運用到檢測房顫患者的VK1和WF對映異構體濃度的臨床試驗中，且方法簡單易行，值得臨床進一步推廣應用。在中國漢族人群中首次證明了VKORC1和CYP4F2基因多態(tài)性顯著地影響血漿中VK1濃度。本研究結果建議在使用WF時要注意VKORC1和CYP4F2基因多態(tài)性、維生素K1水