黃芩素改善線粒體功能、增強(qiáng)白癜風(fēng)黑素細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力的作用和機(jī)制研究.pdf

1、白癜風(fēng)是常見慢性皮膚及黏膜色素脫失性疾病，患者約占世界人口的0.5-1％，約50%的患者在20歲前發(fā)病。皮膚白斑雖然無自覺不適，但嚴(yán)重危害患者的心理健康，尤其是青少年和青年，造成患者自卑、孤僻等。
　　白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制尚未得以充分闡明?；谧陨砻庖邔W(xué)說，臨床上外用糖皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑，以及NB-UVB照射等治療白癜風(fēng)，可獲一定的治療效果。但是這些治療手段對于預(yù)防白癜風(fēng)的復(fù)發(fā)以及對進(jìn)展期白癜風(fēng)的治療明顯不足。一般認(rèn)為自身免疫只是出

2、現(xiàn)在該病黑素細(xì)胞損害的效應(yīng)階段，激活和引發(fā)自身免疫的具體機(jī)制仍不明確。近年來，氧化應(yīng)激學(xué)說得到普遍關(guān)注，并得到一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持。抗氧化劑治療白癜風(fēng)也在臨床上進(jìn)行了一些嘗試。線粒體是細(xì)胞內(nèi) ROS產(chǎn)生的主要部位，正常情況下其具有完善的抗氧化體系，當(dāng)線粒體功能障礙時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS堆積，導(dǎo)致線粒體損傷。研究發(fā)現(xiàn)，白癜風(fēng)患者皮損處（角質(zhì)形成細(xì)胞）和皮損周（黑素細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞）細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)損害，進(jìn)一步支持氧化應(yīng)激致病學(xué)說。

3、　　黃芩素（Baicalein，BE）是從植物黃芩的根中提取的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗細(xì)菌等作用。我們課題組前期研究證實(shí)，BE通過抑制p38MAPK通路對抗正常人黑素細(xì)胞系（PIG1）氧化應(yīng)激損傷，另外BE減少CytC釋放，通過抑制線粒體凋亡途徑保護(hù)PIG1細(xì)胞，但是具體機(jī)制尚不明確。核因子E2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Nrf2）是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)Nrf2可以提高黑素細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力，誘導(dǎo)HO-1是Nrf2的

4、作用機(jī)制之一。在白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞系（PIG3V）中BE是否具有提高細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激損傷能力，改善線粒體功能障礙的作用？其發(fā)揮作用的具體機(jī)制又是什么？Nrf2提高黑素細(xì)胞抗氧化能力是否存在其他機(jī)制？為了解決以上問題，我們提出了如下假說：BE通過激活Nrf2-NRF1-TFAM通路，發(fā)揮改善線粒體功能障礙、促進(jìn)線粒體生物合成，從而增強(qiáng)黑素細(xì)胞抗氧應(yīng)激損傷能力。本研究以PIG3V細(xì)胞為研究對象，在細(xì)胞水平觀察BE改善線粒體功能障礙、促進(jìn)線粒

5、體生物合成和增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力的作用并對其機(jī)制進(jìn)行初步探究，為闡明BE的抗氧化機(jī)制提供新思路，為其用于白癜風(fēng)的臨床治療奠定理論基礎(chǔ)。
　　研究內(nèi)容：
　　1.BE對氧化應(yīng)激下PIG3V細(xì)胞形態(tài)、存活率以及線粒體超微結(jié)構(gòu)、功能和生物合成的影響；
　　2.BE對于Nrf2以及線粒體合成相關(guān)基因的影響；
　　3.過表達(dá)Nrf2對線粒體生物合成及功能的影響。
　　研究方案:
　　1.建立PIG3V細(xì)胞氧化應(yīng)激

6、模型，觀察BE預(yù)處理的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)分組及處理?xiàng)l件：對照組：黑素細(xì)胞培養(yǎng)基；BE組：40μM/L BE處理1h，其后換用黑素細(xì)胞培養(yǎng)基處理；H2O2組，0.75mM/L H2O2處理；BE+H2O2組；40μM/L BE處理1h，其后換用0.75mM/L H2O2處理。顯微鏡下觀察BE對PIG3V細(xì)胞的保護(hù)作用；CCK-8法檢測細(xì)胞存活率；電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)變化；MTT法檢測線粒體活性；ENLITEN?ATP檢測試劑盒檢測ATP水平

7、；流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位和細(xì)胞內(nèi)ROS；Real-time PCR（RT-PCR）檢測線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)。
　　2.蛋白免疫印跡檢測BE對PIG3V細(xì)胞Nrf2及線粒體合成相關(guān)蛋白（NRF1、TFAM）的影響；
　　3.采用Nrf2過表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PIG3V細(xì)胞，建立Nrf2過表達(dá)模型，觀察過表達(dá)Nrf2對線粒體生物合成和功能的影響。熒光顯微鏡觀察和蛋白免疫印跡確認(rèn)過表達(dá)模型是否構(gòu)建成功；ENLITEN?

8、ATP檢測試劑盒檢測ATP產(chǎn)量；流式細(xì)胞術(shù)檢測MMP；RT-PCR、蛋白免疫印跡檢測線粒體合成相關(guān)基因的mRNA和蛋白水平；RT-PCR檢測mtDNA拷貝數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1.形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞存活率檢測顯示BE保護(hù)氧化應(yīng)激下PIG3V細(xì)胞，提高其抵抗氧化應(yīng)激損傷的能力；
　　2.BE減輕氧化應(yīng)激下PIG3V細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的損害；
　　3.BE改善氧化應(yīng)激下PIG3V細(xì)胞線粒體功能障礙：增強(qiáng)線粒體活性、提高

9、MMP、促進(jìn)ATP生成、降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平；
　　4.BE促進(jìn)氧化應(yīng)激下PIG3V細(xì)胞線粒體生物合成；
　　5.BE上調(diào)Nrf2通路，促進(jìn)PIG3V細(xì)胞線粒體生物合成相關(guān)蛋白（NRF1、TFAM）表達(dá)；
　　6.過表達(dá)Nrf2改善線粒體功能：提高線粒體膜電位、促進(jìn)ATP生成；
　　7.過表達(dá)Nrf2促進(jìn)線粒體合成：線粒體生物合成相關(guān)（NRF1、TFAM）mRNA、蛋白水平升高；mtDNA拷貝數(shù)增加。