DJ-1在黑素細(xì)胞抗氧化應(yīng)激中的作用研究.pdf

1、白癜風(fēng)是一種臨床上常見的色素脫失性皮膚病，其發(fā)病機(jī)制目前仍不完全清楚，其中涉及遺傳背景、氧化應(yīng)激、自身免疫、精神神經(jīng)等多種因素。近年來研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在白癜風(fēng)發(fā)病中發(fā)揮重要作用。
　　正常情況下，皮膚氧化-抗氧化系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，而白癜風(fēng)患者中這一平衡被打破。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)展期白癜風(fēng)患者表皮中H2O2濃度可高達(dá)為10-3M，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常人的10-7M-10-6M生理濃度。高濃度的H2O2誘導(dǎo)了白癜風(fēng)的發(fā)生并促進(jìn)了白癜風(fēng)的發(fā)展

2、。
　　DJ-1/PARK7基因編碼DJ-1蛋白，發(fā)現(xiàn)于1997年，曾被認(rèn)為是癌基因。目前的研究發(fā)現(xiàn)其具有多種生物學(xué)功能：包括促進(jìn)細(xì)胞增殖，參與雄性精子成熟與受精，抵抗氧化應(yīng)激等。隨著研究的深入，其抗氧化應(yīng)激功能日益被重視。但DJ-1在黑素細(xì)胞中是否表達(dá)及其功能如何尚未見報(bào)道。
　　本試驗(yàn)以人原代培養(yǎng)黑素細(xì)胞為對(duì)象，采用H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和siRNA干涉技術(shù)觀察DJ-1基因?qū)?xì)胞形態(tài)、增殖活力、細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生及凋亡的影響

3、，以驗(yàn)證其對(duì)黑素細(xì)胞是否具有抗氧化應(yīng)激保護(hù)作用。
　　第一部分實(shí)驗(yàn)：DJ-1在黑素細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)鑒定、H2O2適宜濃度及DJ-1特異性有效siRNA序列篩選
　　1.主要方法
　　采用免疫熒光方法鑒定DJ-1在原代培養(yǎng)黑素細(xì)胞中的表達(dá)；使用不同濃度H2O2處理黑素細(xì)胞24h，改良MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，選取適宜濃度H2O2作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件；設(shè)計(jì)并合成三對(duì)DJ-1特異性siRNA，反向轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)人黑素細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組包括空白

4、對(duì)照組（不含siRNA），陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA-negativecontrol）及實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染siRNA-DJ-1），于轉(zhuǎn)染后24h及48h分別行Q-RT-PCR及Westernblot檢測(cè)DJ-1mRNA及蛋白表達(dá)情況，篩選干涉效率最高的siRNA片段。
　　2．主要結(jié)果
　　免疫熒光顯示DJ-1在細(xì)胞核和胞質(zhì)中均表達(dá)，以細(xì)胞核表達(dá)為主；細(xì)胞活力隨H2O2濃度增高呈劑量依賴關(guān)系下降，0.5mMH2O2處理24

5、h后，細(xì)胞活力開始下降(P<0.05vscontrol)，此濃度作為誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)條件；Q-RT-PCR及Westernblot結(jié)果顯示siRNA-DJ-1-687對(duì)靶基因的抑制效果最好。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了DJ-1-siRNA-687的細(xì)胞組DJ-1mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯降低(P<0.05vscontrol)。
　　3.主要結(jié)論
　　本部分實(shí)驗(yàn)證實(shí)DJ-1表達(dá)于人黑素細(xì)胞中，篩選出了適宜處理濃度的H2O2及最有效的

6、siRNA-DJ-1序列，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
　　第二部分實(shí)驗(yàn)：DJ-1通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS和抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)黑素細(xì)胞抵抗H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷
　　1.主要方法
　　用0.5mMH2O2處理黑素細(xì)胞24h后，Q-RT-PCR和Westernblot檢測(cè)DJ-1mRNA和蛋白表達(dá)變化情況；使用siRNA-DJ-1-687反向轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)黑素細(xì)胞，設(shè)空白對(duì)照組（不含siRNA），陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA

7、-NC）及實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染siRNA-DJ-1）。細(xì)胞貼壁后，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異；轉(zhuǎn)染48h后，使用0.5mM的H2O2處理三組黑素細(xì)胞24h，改良MTT法、熒光探針2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)、膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(AnnexinⅤ-FITC/PI)分別檢測(cè)細(xì)胞活力變化、細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)水平及細(xì)胞凋亡比例。
　　2.主要結(jié)果
　　0

8、.5mMH2O2處理細(xì)胞24h后，處理組DJ-1表達(dá)增高為對(duì)照的2.23倍(P<0.05vsuntreated)；干涉DJ-1表達(dá)，細(xì)胞貼壁后，siRNA-DJ-1組黑素細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相比，樹突減少縮短，胞漿空泡化改變；使用0.5mMH2O2處理24h后，siRNA-DJ-1組細(xì)胞活力為對(duì)照組的35％(P<0.05vscontrol)；細(xì)胞內(nèi)ROS的fluorescenceintensity(FI)值(902±40)和凋亡比例(58％

9、±6.1％)增高，與對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)ROS的FI值(529±32)和凋亡比例(30％±3.8％)相比，P值均<0.05；
　　3.主要結(jié)論
　　我們的研究證實(shí)在H2O2所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞中DJ-1表達(dá)增高，從而發(fā)揮其保護(hù)作用，DJ-1在黑素細(xì)胞中能夠通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平和抑制細(xì)胞凋亡來抵抗H2O2所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。此外，即使在無外源性氧化應(yīng)激存在時(shí)，DJ-1表達(dá)被抑制后黑素細(xì)胞出現(xiàn)樹突縮短、空泡化等改變，提示DJ