FAK對不同分化狀態(tài)的神經干細胞定向遷移的調控研究.pdf

1、神經干/祖細胞（Neural stem/progenitor cells，NSCs）的遷移對哺乳動物神經系統的發(fā)育和損傷修復至關重要。許多神經退行性疾病的發(fā)生是由于NSCs遷移缺陷導致的，所以激發(fā)內源或外源移植的NSCs向神經損傷部位的遷移，是治療神經性疾病的關鍵因素。我們的前期研究已表明，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）誘導的NSCs趨化遷移與其分化狀態(tài)、粘著斑（foc

2、al adhesion, FA）動態(tài)變化及肌動蛋白（F-actin）細胞骨架重塑相關。粘著斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）作為胞質酪氨酸激酶，在生長因子介導的信號通路及細胞遷移過程中起著關鍵作用，然而其在NSCs的趨化遷移過程中的作用還未被知詳。本實驗研究將探討在不同分化狀態(tài)的NSCs趨向VEGF的遷移過程中，FAK對FA的動態(tài)變化和分布的調控作用，及其與PI3K/Akt、MAPKs和Rac1信號通路之間的

3、相互調節(jié)機制。
　　利用C17.2 NSCs進行趨化遷移實驗發(fā)現，PF573228（FAK抑制劑，簡稱PF-228）抑制FAK活性后，顯著抑制了VEGF誘導的不同分化狀態(tài)的細胞趨化遷移：Boyden chamber群體細胞遷移實驗，未分化、分化1 d和分化3 d的NSCs的遷移數量均減少；Dunn chamber單細胞趨化遷移實驗，未分化和分化1 d的NSCs向VEGF的趨化遷移明顯受抑，細胞的遷移速度降低，遷移持續(xù)性也下降。另外

4、，PF-228顯著抑制VEGF誘導的胎鼠大腦皮層神經球和大鼠SVZ神經球的鋪展及遷移，神經球的鋪展半徑減小，細胞遷移的速度也降低。
　　FA在細胞遷移過程中呈不斷形成-解聚的動態(tài)周轉狀態(tài)，FAK可以通過影響FA的形成及動態(tài)組裝從而調控細胞遷移。免疫熒光染色發(fā)現，細胞在VEGF誘導下易伸出偽足，胞內的微絲結構發(fā)生重塑。許多小斑點樣的FA在片狀偽足處形成，FA的總數量增加。而在PF-228作用下，FA總數量減少，新生FA比例下降，成熟

5、FA比例增加，說明不僅FA的形成受到抑制，而且成熟FA的解聚也受阻。并且在PF-228作用下，VEGF促進的pY397-FAK和pY31/pY118-paxillin的磷酸化作用顯著下調。
　　細胞遷移至劃痕區(qū)域過程中，VEGF誘導的新生FA主要分布在鋪展的片狀偽足處，前后FA極性分布比例較大，而PF-228處理后，成熟穩(wěn)定的FA僅局限分布在細胞邊緣。相應的，活細胞跟蹤觀察FA動態(tài)變化發(fā)現，VEGF顯著提高了FA的周轉速度，FA的

6、組裝加快，在細胞遷移前端不斷形成小斑點FA，細胞尾端的FA也快速解聚；而PF-228作用下，細胞周邊的FA斑點較大，周轉緩慢，細胞尾端的FA解聚也較慢。轉染FAK活性突變體發(fā)現，pRKGFP-FAK能夠響應VEGF的刺激，FA數量變多，長度變短，而FAK-Y397F失活型指示的FA顯著長于pRKGFP-FAK指示的FA，并且不響應VEGF的刺激，FA沒有變化。說明FAK的Y397位點的活化在FA動態(tài)變化中起著關鍵作用。
　　PF-

7、228抑制FAK活性后，不同程度的抑制了PI3K/Akt和MAPKs信號通路的下游分子，包括Akt、ERK1/2、SAPK/JNK和p38MAPK的磷酸化作用，所以FAK影響細胞遷移及FA形成可能與PI3K和MAPKs信號轉導通路有關：抑制PI3K/Akt或MAPKs信號通路，不同程度的阻礙了大鼠SVZ神經球的遷移及VEGF誘導的細胞遷移，特別是ERK1/2和SAPK/JNK信號通路顯著長效的抑制了神經球的鋪展；不同分化狀態(tài)的FA形成也

8、受到不同程度的抑制；劃痕遷移過程中，細胞不具明顯的極性形態(tài)，細胞前后端FA的極性分布比例也降低；Western blot也發(fā)現，VEGF誘導的FAK和Y31/118-paxillin的磷酸化也減弱，說明在細胞遷移及FA動態(tài)周轉過程中，FAK與PI3K/Akt和MAPKs通路之間可能是相互調節(jié)的作用機制。
　　最后，我們檢測了調控F-actin細胞骨架的Rac1-GTPase在VEGF誘導的細胞遷移和FA形成中的作用。過表達Rac1

9、激活型突變體Rac1-Q61L和Rac1-G12V，細胞趨化遷移的效率顯著升高，片狀偽足的伸展具有方向持續(xù)性，并且FA的數量顯著增多。而轉染Rac1顯性陰性突變體Rac1-T17N，FA的數量較少，說明活化的Rac1促進FA形成，失活的Rac1抑制FA形成。在VEGF刺激下，pIRES2-GFP對照細胞和Rac1野生型細胞中的FA增加，而Rac1-Q61L和Rac1-G12V的細胞中的FA數量沒有進一步增多，Rac1-T17N的細胞也不

10、響應VEGF的刺激，說明VEGF誘導的FA形成過程中需要Rac1的活化。另外，FAK抑制劑作用下，無論是Rac1野生型還是Rac1激活型細胞中的FA形成均受到抑制，說明Rac1參與調控FA的形成最終還是需要通過FAK的活化。
　　綜上所述，通過本實驗研究，我們明確了FAK在不同分化狀態(tài)的細胞遷移中的作用，弄清了FAK對FA動態(tài)周轉的調控機制，及其在此過程中與PI3K/Akt、MAPKs和Rac1信號通路相互作用的機制，為更好的調控