具有生物安全性的新型載鋅鈦材料的制備及其抗菌性研究.pdf

1、傳統(tǒng)金屬植入材料（如不銹鋼、鈦、鈦合金等）因其具有優(yōu)異的生物相容性、優(yōu)良的機(jī)械加工性能和耐腐蝕性能，以及其彈性模量與人骨相近等特性，已被廣泛應(yīng)用于骨科、齒科、矯形外科等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。但是在應(yīng)用過(guò)程中亦產(chǎn)生一些新的問(wèn)題，比如應(yīng)力遮擋，假體松動(dòng)，植入物相關(guān)感染等，而其中植入物感染尤其突出且產(chǎn)生嚴(yán)重后果。由于感染后植入材料表面極易形成細(xì)菌生物膜，該細(xì)菌生物膜具有隔絕人體免疫系統(tǒng)攻擊，以及抵抗抗生素的滲透作用，為患者帶來(lái)了巨大的病痛及負(fù)擔(dān)，增加

2、臨床治療的難度。目前臨床上治療植入物相關(guān)感染常用再次手術(shù)清創(chuàng)翻修，局部注射高劑量抗生素等，而這些治療均有其明顯局限性，再次手術(shù)增加病人痛苦及負(fù)擔(dān)，大劑量應(yīng)用抗生素則會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥等問(wèn)題。因此，怎樣降低或者避免這類(lèi)假體植入術(shù)后感染的發(fā)生已經(jīng)成為醫(yī)療領(lǐng)域面臨和亟待解決的重大難點(diǎn)問(wèn)題。而金屬離子具有廣譜抗菌性，體內(nèi)良好分散性，且?guī)缀醪划a(chǎn)生耐藥菌等優(yōu)點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出具有抗菌特性的金屬離子型植入假體材料，已經(jīng)成為新型材料開(kāi)發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)。而金屬離子主要為

3、銀、鋅、銅離子應(yīng)用于生物材料研究中最為廣泛，本課題擬通過(guò)堿熱反應(yīng)將金屬鋅離子載入醫(yī)用純鈦表面為研究對(duì)象，系統(tǒng)研究該新型載鋅鈦生物材料的生物安全性、抗菌性能及體內(nèi)安全性，為新型載鋅鈦抗菌植入材料的研究與發(fā)展以及進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究目的:
　　擬通過(guò)堿熱法于純鈦表面形成多孔鈦微納米結(jié)構(gòu)，同時(shí)于材料表面載入鋅離子構(gòu)建一種新型純鈦表面載鋅材料，以該新型載鋅鈦材料作為實(shí)驗(yàn)組和純鈦材料為對(duì)照組為研究對(duì)象，以細(xì)胞與材料

4、共培養(yǎng)的研究方法研究該新型載鋅鈦材料的血液相容性、細(xì)胞相容性。采用細(xì)菌與材料共培養(yǎng)方法研究其體外抗菌性能。構(gòu)建植入物相關(guān)感染模型，研究該新型載鋅鈦材料在動(dòng)物體內(nèi)抗菌性及毒性，為抗菌植入材料新材料的研發(fā)與生物醫(yī)學(xué)相關(guān)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究材料與方法:
　　以堿熱法制備的新型載鋅鈦抗菌植入材料為研究對(duì)象，以目前臨床廣泛應(yīng)用的植入純鈦為對(duì)照組。選用金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株為抗菌實(shí)驗(yàn)研究細(xì)菌，利用材料與細(xì)菌共培養(yǎng)方法，通過(guò)共培養(yǎng)后

5、予以瓊脂板計(jì)數(shù)方法測(cè)定該材料的抗菌性，選用美國(guó)ATCC購(gòu)買(mǎi)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSC)為實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞。利用材料與細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，通過(guò)對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSC)的增殖檢測(cè)材料對(duì)細(xì)胞的毒性、材料表面細(xì)胞Live/Dead染色觀察、材料的急性溶血實(shí)驗(yàn)、材料表面細(xì)胞掃描電鏡觀察等實(shí)驗(yàn)對(duì)新型載鋅鈦抗菌植入材料的血液相容性、細(xì)胞相容性做系統(tǒng)的研究;通過(guò)材料與金黃色葡萄球菌的共培養(yǎng)，測(cè)定該新型載鋅鈦抗菌生物材料的抗菌性能，并對(duì)材料與細(xì)

6、菌共培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行電鏡掃描觀察其形態(tài)變化，從而對(duì)新型載鋅鈦抗菌植入材料的殺菌機(jī)制進(jìn)行假想及推測(cè)。以新西蘭大白兔為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，予以激素行免疫抑制構(gòu)建一種植入物感染易感動(dòng)物模型，研究新型載鋅鈦抗菌植入材料在動(dòng)物體內(nèi)抗菌性及毒性作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　(1)采用堿熱法成功制備出鈦表面多孔結(jié)構(gòu)，同時(shí)使用化學(xué)法將鋅附著于鈦表面，而后再行模擬生物礦化達(dá)到使鋅緩釋的目的。
　　(2)通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、材料表面細(xì)胞死活染色實(shí)

7、驗(yàn)、急性溶血實(shí)驗(yàn)及材料表面細(xì)胞形態(tài)電鏡觀察，證實(shí)該新型載鋅鈦生物材料具有良好的生物相容性;
　　(3)材料與細(xì)菌共培養(yǎng)法測(cè)定載鋅鈦生物材料其具有良好的殺菌效果，殺菌率在90％以上，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　(4)通過(guò)以新西蘭大白兔植入物帶入感染易感模型為應(yīng)用模型，將涂有一定量細(xì)菌的純鈦組及新型載鋅鈦生物材料植入兔股骨髁，觀察到動(dòng)物體溫均有升高，實(shí)驗(yàn)組體溫增高幅度較對(duì)照組低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，傷口感染情況實(shí)驗(yàn)組較輕，靜

8、脈血中白細(xì)胞數(shù)低于純鈦組，新型載鋅鈦生物材料周?chē)墙M織單位重量的細(xì)菌含量較純鈦對(duì)照組細(xì)菌含量要低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。且靜脈血中鋅元素實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即新型載鋅鈦生物材料在體內(nèi)亦具有一定的抗菌作用，且不影響血鋅的含量。
　　結(jié)論：
　　(1)通過(guò)載鋅鈦材料與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)后進(jìn)行瓊脂板細(xì)菌計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新型載鋅鈦抗菌植入材料與純鈦組相比較其殺菌率為90％以上。該材料在體外抗菌實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌性

9、，而通過(guò)檢測(cè)該新型材料的鋅離子溶出累積量而繪制曲線(xiàn)，可發(fā)現(xiàn)該材料的鋅離子早期釋放快，而后緩慢釋放。通過(guò)鋅離子與細(xì)菌共培養(yǎng)后進(jìn)行透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌膜破裂，推測(cè)金屬離子的殺菌機(jī)制為破壞細(xì)菌膜進(jìn)行殺菌。
　　(2)通過(guò)載鋅鈦材料與健康人血進(jìn)行共培養(yǎng)，我們發(fā)現(xiàn)該新型載鋅鈦抗菌植入材料的溶血率為0.36％，遠(yuǎn)低于植入物溶血率最低要求5％，證明載鋅鈦生物材料具有良好的血液相容性。通過(guò)材料與hBMSC細(xì)胞的共培養(yǎng)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性;

10、通過(guò)SME掃描電鏡從直觀上觀察細(xì)胞在材料表面的黏附、伸展，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞偽足與材料表面接觸良好;將材料與細(xì)胞共培養(yǎng)后進(jìn)行死活細(xì)胞染色，結(jié)果證明活細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)多于死細(xì)胞，證實(shí)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在新型載鋅鈦抗菌植入材料表面生長(zhǎng)良好。總體說(shuō)明載鋅鈦抗菌植入材料具有良好的細(xì)胞相容性。
　　(3)通過(guò)將涂布細(xì)菌的新型載鋅鈦抗菌植入材料植入激素免疫抑制的新西蘭白兔股骨髁處，通過(guò)檢測(cè)體溫體重、傷口大體觀察、檢測(cè)血白細(xì)胞等感染指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)該材料的在體內(nèi)的感

11、染情況要低于對(duì)照組，證明該新型載鋅鈦抗菌植入材料在體內(nèi)亦能發(fā)揮一定抗菌作用，且觀察血液中鋅離子濃度與正常新西蘭白兔無(wú)明顯差異。證明植入該材料后不影響血液中鋅的代謝情況，證明體內(nèi)生物相容性良好。
　　綜上所述，新型載鋅鈦抗菌植入材料具有良好的抗菌性和生物相容性，且鋅離子的殺菌機(jī)制為破壞細(xì)菌膜的結(jié)構(gòu)，達(dá)到殺菌效果，另一方面，由于該材料具有良好的生物相容性，故該材料與細(xì)胞適配性好可以減少細(xì)菌生存空間，達(dá)到進(jìn)一步抑菌的效果。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明該