外泌體介導的miR-222及其衍生物在乳腺癌耐藥中的研究.pdf

1、目的:
　　乳腺癌化療耐藥是乳腺癌（尤其晚期乳腺癌）患者治療失敗最常見和最難克服的問題之一，也是腫瘤復發(fā)、轉移的主要原因。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)miR-222能夠增強乳腺癌細胞的耐藥性，同時miR-222水平在阿霉素耐藥的乳腺癌細胞株(MCF/ADR)的外泌體中明顯升高，但是其通過外泌體傳遞耐藥的機制并未完全闡明。因此，本課題通過裝載miR-222的衍生物(mimic/inhibitor)進入外泌體，建立特殊的外泌體-mimic/

2、inhibitor復合體模型，探討外泌體中miR-222對乳腺癌耐藥的作用及其潛在機制。
　　方法:
　　1、以MCF/7細胞系構建出的耐藥株MCF-7/ADR和同步非加藥培養(yǎng)的敏感株MCF-7/S為研究對象。免疫熒光驗證耐藥細胞和敏感細胞的P糖蛋白和TSG101蛋白的表達水平，同時蛋白定量精確測定耐藥細胞和敏感細胞分泌的外泌體量差。
　　2、使用共聚焦顯微觀察攝取不同量（50μg、100μg、200μg）耐藥細胞外泌

3、體(A-exos)的敏感細胞;qRT-PCR法檢測各組細胞中miR-222的水平;用流式細胞術檢測各組經(jīng)外泌體處理后的細胞與阿霉素共培養(yǎng)后的凋亡率。
　　3、建立電轉方程，以最佳條件將miR-222 mimic導入HBL-100外泌體(mimic-exos);研究mimic-exos對敏感細胞耐藥性的影響。
　　4、通過電轉染將miR-222 inhibitor導入外泌體(inhibitor-exos)，耐藥細胞與inhib

4、itor-exos共培養(yǎng)后，檢測各組細胞miR-222和PTEN的表達變化以及相應細胞耐藥性的變化;Western blot和免疫熒光實驗驗證PTEN的蛋白表達。
　　5、通過比較腫瘤的生長曲線，在荷瘤小鼠體內驗證瘤內注射inhibitor-exos對腫瘤耐藥細胞的作用，并檢測腫瘤組織以及小鼠血清外泌體中miR-222和PTEN的表達變化。
　　6、在新輔助化療后的乳腺癌患者腫瘤標本中通過免疫組化染色方法驗證了PTEN及外泌

5、體標記蛋白TSG101的表達。
　　結果:
　　1.耐藥細胞和敏感細胞P糖蛋白和TSG101蛋白的表達明顯上調;相同體積的細胞上清中，耐藥株MCF-7/ADR分泌的外泌體(A-exos)遠遠高于敏感株MCF-7/S所分泌的外泌體(S-exos)。
　　2.加入的外泌體量越多，細胞攝取的量也越多;攝取了更多外泌體(100μg、200μg)的敏感細胞耐藥性要明顯高于攝取少量外泌體(50μg)的敏感細胞;攝取了更多耐藥細胞外

6、泌體的細胞中miR-222水平明顯高于其他組的細胞。
　　3.最佳電轉染條件:50μg/100μL外泌體，轉染時電壓180V;成功構建mimic-exos復合體，與敏感細胞共培養(yǎng)后可明顯增強其對阿霉素的耐藥性。
　　4.加入inhibitor-exos共培養(yǎng)的耐藥細胞的對阿霉素的耐藥性減低，流式細胞術檢測細胞凋亡率明顯增加;且伴隨細胞中miR-222水平下調和PTEN的表達增強。
　　5.瘤內注射inhibitor-e

7、xos的小鼠腫瘤大小明顯小于對照和空白組，腫瘤組織中的miR-222水平下調，且靶基因PTEN的表達增強。
　　6.檢測接受新輔助化療的乳腺癌患者腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)PTEN在耐藥組中低表達，外泌體標記蛋白TSG101在耐藥組中高表達。
　　結論:
　　1.耐藥細胞比敏感細胞分泌更多的外泌體。
　　2.耐藥細胞的外泌體能夠通過傳遞miR-222增強敏感細胞的耐藥性。
　　3.構建的mimic-exos復合體和in