非綜合征型耳聾高通量檢測技術及致病突變研究.pdf

1、耳聾是最常見的出生缺陷性疾病之一，約60％的耳聾與遺傳因素有關。遺傳性耳聾具有高度的遺傳異質性和廣泛的種族差異，中國耳聾分子流行病學調查數(shù)據(jù)顯示，GJB2基因、SLC26A4基因和線粒體基因12S rRNA是中國耳聾人群主要致病基因，這為在中國開展耳聾基因診斷奠定了基礎。
　　為了滿足中國臨床對耳聾基因診斷的需求，本論文建立了一個從常見耳聾基因突變高通量檢測到罕見耳聾基因突變高效鑒定的耳聾基因診斷體系。本論文利用自動移液工作站和飛

2、行時間質譜技術建立了一套包括自動化樣本制備和高通量耳聾基因檢測的中國人常見耳聾基因高通量檢測技術體系，并使用臨床樣本對該檢測體系的準確性及有效性進行了評價;采用靶向基因捕獲和高通量測序技術建立了一套可高效鑒定非綜合征型耳聾患者的新致病突變的體系。上述兩個檢測體系組成了一個完整的非綜合征型耳聾基因檢測的解決方案，對提高中國耳聾基因診斷的水平具有較大意義。
　　本論文根據(jù)中國耳聾分子流行病學調查數(shù)據(jù)，選擇了中國人群常見的3個耳聾致病基

3、因（GJB2、SLC26A4、線粒體12S rRNA）共30個突變位點，建立了基于飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)技術的單一反應檢測這30個突變位點的高通量檢測方法，利用該方法檢測了327例臨床明確基因診斷的非綜合征型耳聾樣本，30個突變均得到檢出，而且本論文檢測方法的結果與臨床基因診斷結果一致，符合率100％;進一步使用該方法檢測了373例非綜合征型耳聾患者樣本，發(fā)現(xiàn)210例患者攜帶至少一個突變(56.30％，210/373)

4、，確診患者155例(41.55％，155/373)，其中GJB2基因致聾者63例(16.89％，30/373)，SLC26A4基因致聾者88例(23.59％，88/373)，線粒體基因12S rRNA致聾者4例(1.07％，4/373)，并使用基因檢測的金標準Sanger測序法對分型結果進行了驗證，兩種方法結果一致，符合率100％;也基于自動移液工作站建立了血斑樣本DNA自動化制備方法，應用該方法和4種磁珠法DNA提取試劑盒提取了64個

5、新生兒血斑樣本DNA，DNA平均濃度在10.76ng/μl至21.88ng/μl之間，平均純度260/280在1.84至1.99之間，使用飛行時間質譜方法檢測這64個樣本，發(fā)現(xiàn)了5個耳聾基因突變攜帶者。
　　選取了92例已使用本研究建立的質譜檢測方法未能確診的非綜合征型耳聾樣本，這92例耳聾樣本包括了90個先證者樣本及2個受累同胞樣本，應用包括200個耳聾相關基因的靶向基因捕獲測序技術檢測了這92例非綜合征耳聾樣本，對鑒定到的突變

6、進行了生物信息學分析，并使用直接測序法對鑒定出的突變進行了驗證。結果顯示，有20個先證者可以確診，診斷率為22.2％，這20個確診的先證者的38個致病突變分布在15個耳聾基因上，其中23個是新致病突變。
　　本論文基于自動移液工作站和飛行時間質譜建立的中國人常見耳聾基因高通量檢測技術體系，具有高通量、高準確性、低成本等特點，可以對耳聾患者進行準確快速診斷，為規(guī)模化耳聾防控提供了有力的技術支撐。本論文建立的包含200個耳聾基因的靶向