基于線粒體功能失調(diào)與Nrf2介導的抗氧化應(yīng)激探索柚皮素對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用.pdf

1、目的:
　　為探討柚皮素對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用及其可能機制，本研究以SD大鼠為實驗對象，分別采用體外原代皮層神經(jīng)細胞培養(yǎng)糖氧剝奪/再灌注(oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/Rep)模型和大鼠大腦中動脈缺血再灌注(MACO)模型，從體外和動物模型不同角度探索柚皮素干預對腦缺血再灌注損傷的保護作用及其與線粒體功能失調(diào)以及核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)通路調(diào)控的抗氧化

2、應(yīng)激的關(guān)系，明確柚皮素對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用的分子機理。
　　方法:
　　體外研究實驗:
　　1、用NES-FITC及DAPI對對數(shù)生長期的大鼠皮層神經(jīng)元細胞進行免疫熒光染色鑒定。
　　2、SD大鼠大腦皮層神經(jīng)細胞建立OGD/Rep模型。
　　3、(1)用不同濃度NAR干預48h后，檢測細胞凋亡情況。(2)檢測凋亡蛋白Capase-3、bax、bcl-2、Cyt C蛋白和基因表達水平。(3)電鏡觀

3、察各組線粒體結(jié)構(gòu)，檢測其膜電勢和腺苷酸含量變化。(4)檢測ROS、MDA和GSH水平及SOD活性。
　　4、(1)siRNA-Nrf2、OENrf2干擾Nrf2表達，行OGD/Rep處理，再給予80Mm NAR處理48h后，檢測細胞凋亡情況。(2)檢測ROS、MDA和GSH水平及SOD活性。(3)檢測Nrf2蛋白轉(zhuǎn)移情況以及其與ARE結(jié)合的情況。(4)檢測Nrf2、Keap1、HO-1和NOQ1蛋白和基因表達水平。
　　體內(nèi)

4、研究實驗:
　　1、利用線栓法建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)動物模型，給予不用濃度NAR處理，術(shù)后進行神經(jīng)行為學評分、TTC染色、腦含水量測定以及HE染色。
　　2、給予MCAO模型不同濃度NAR處理72h后，(1)電鏡掃描觀察各組線粒體結(jié)構(gòu)，檢測其膜電勢和腺苷酸含量變化;(2)檢測腦組織內(nèi)ROS、MDA和GSH水平及SOD活性;(3)觀察腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況，檢測腦組織Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1蛋

5、白表達情況，檢測Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1基因表達情況，同時檢測Nrf2的DNA結(jié)合活力和Keap1亞硝基化情況。
　　結(jié)果:
　　體外研究結(jié)果:
　　1、與正常對照相比，模型組細胞活性低，凋亡率高，差異顯著(P＜0.05)，與模型組對比，不同濃度NAR預處理后，細胞活性提高、凋亡率下降，NAR-H組最為顯著(P＜0.05)。
　　2、與正常組比較，模型組Capase-3，bax及Cyt C表達上調(diào)

6、，bcl-2表達下調(diào)(P＜0.05)。與模型組相比，經(jīng)過不同濃度NAR預處理后，Capase-3，bax及Cyt C表達下調(diào)，bcl-2表達上調(diào)。其中NAR-H組最為顯著(P＜0.05)。
　　3、NAR預處理可改善線粒體形態(tài)，提高其膜電位及腺苷酸合成能力，提高SOD、GSH水平，降低ROS、MDA水平。
　　4、與模型組比較，轉(zhuǎn)染OENrf2組和NAR組細胞活性提高，凋亡率下降，OENrf2組最為顯著(P＜0.05);轉(zhuǎn)染

7、Nrf2-siRNA組則相反(P＜0.05)。
　　5、與模型組比較，轉(zhuǎn)染OENrf2組和NAR組SOD、GSH水平提高，ROS、MDA水平下降，OENrf2組最為顯著(P＜0.05);轉(zhuǎn)染Nrf2-siRNA組則無明顯差異(P＞0.05)。
　　7、與模型組比較，轉(zhuǎn)染OENrf2組和NAR組細胞質(zhì)Nrf2蛋白表達增加，而胞漿表達減少，OENrf2組最為顯著(P＜0.05);轉(zhuǎn)染Nrf2-siRNA組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0

8、.05）。
　　8、NAR誘導Nrf2表達，促進Nrf2通路下游蛋白Nrf2、Keap1、HO-1和NOQ1的表達。
　　體內(nèi)研究結(jié)果:
　　1、NAR預處理組腦梗死面積、神經(jīng)行為學評分和腦水含量均顯著優(yōu)于模型組。
　　2、NAR預處理組線粒體正常結(jié)構(gòu)增加、膜電位增強、腺苷酸合成能力提高，氧化應(yīng)激水平降低，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　3、NAR預處理組細胞凋亡減少，提高Keap1巰基亞硝基化