乙酰谷酰胺及谷紅注射液抗腦缺血再灌注損傷的作用機制研究.pdf

1、腦缺血是導(dǎo)致人類殘疾與死亡的重要疾病之一，給患者的生活造成了極大的影響。目前臨床上腦缺血治療的方案之一是聯(lián)合使用溶栓藥物與神經(jīng)保護藥物。但如何減少經(jīng)溶栓處理后的再灌注損傷已經(jīng)成為一個重要問題。到目前為止，尚缺乏療效確切且能夠?qū)鼓X缺血再灌注損傷的藥物。
　　乙酰谷酰胺注射液是臨床上廣泛應(yīng)用的腦功能改善輔助劑，其治療腦血管疾病的有效性得到了一系列臨床試驗的證實，但迄今為止對乙酰谷酰胺的腦缺血神經(jīng)保護作用機制尚缺乏深入探討，因此，本研

2、究采用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，在整體水平上觀察乙酰谷酰胺抗腦缺血再灌注損傷的有效性，并從細(xì)胞水平、分子水平等多層面探討乙酰谷酰胺的作用機制，為其臨床應(yīng)用提供更全面的理論基礎(chǔ)，為抗腦缺血的新藥研發(fā)提供新思路。
　　谷紅注射液為乙酰谷酰胺和中藥紅花提取物制成的復(fù)方制劑，臨床試驗研究證實谷紅注射液可以減輕急性腦梗死患者的神經(jīng)功能缺損程度，促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)，具有良好的臨床應(yīng)用價值。但由于谷紅注射液的成分較復(fù)雜，目前其作

3、用機制尚不清楚。本研究在明確谷紅注射液具有抗腦缺血再灌注損傷作用的基礎(chǔ)上，采用基因芯片技術(shù)，對谷紅注射液的作用機制進行了初步探討。
　　第一部分、乙酰谷酰胺抗腦缺血再灌注損傷的藥效學(xué)研究
　　1.建立大鼠MCAO模型，模型組大鼠體重顯著減輕(P＜0.05)，神經(jīng)缺損癥狀評分顯著增加（P＜0.001），雙側(cè)前肢完全去除貼紙的時間顯著延長（P＜0.001），經(jīng)過乙酰谷酰胺的治療14d可顯著增加大鼠的體重，減少神經(jīng)缺損癥狀評分并且

4、可以顯著縮短雙側(cè)前肢完全去除貼紙的時間(P＜0.05)。
　　2.乙酰谷酰胺治療14d后，進行平衡桿實驗，MCAO模型組大鼠過桿時間較假手術(shù)組明顯延長（P＜0.01）。而經(jīng)乙酰谷酰胺治療后大鼠過桿總時間明顯縮短（P＜0.05），并且具有較好的劑量依賴關(guān)系。
　　3.Y迷宮實驗結(jié)果顯示:乙酰谷酰胺能顯著改善缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的下降，提高大鼠在Y迷宮實驗中的正確率(P＜0.05)。存自發(fā)運動實驗中，乙酰谷酰胺對

5、缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的精神異常有一定的改善作用。
　　4.TTC染色統(tǒng)計結(jié)果顯示缺血再灌第14d，MCAO模型組大鼠腦梗死體積顯著增加(P＜0.01)，經(jīng)過乙酰谷酰胺治療可以顯著減少腦梗死體積(P＜0.05)。
　　第二部分、乙酰谷酰胺抗腦缺血再灌注損傷的機制研究
　　1.TH免疫組化染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，MCAO模型大鼠黑質(zhì)致密區(qū)內(nèi)單位面積TH陽性細(xì)胞數(shù)目以及紋狀體TH陽性神經(jīng)纖維的累計光密度值(IOD)均顯著

6、降低(P＜0.01)，而乙酰谷酰胺各劑量組單位面積TH陽性細(xì)胞數(shù)目較模型組均顯著增加，TH陽性纖維的IOD值亦顯著增加(P＜0.01)，提示乙酰谷酰胺能明顯改善腦缺血再灌注誘導(dǎo)的黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的繼發(fā)性損傷。
　　2.模型組大鼠黑質(zhì)致密區(qū)內(nèi)單位面積Iba-1陽性細(xì)胞數(shù)目較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01），形態(tài)上由橢圓形、胞體小、突起多的靜止型小膠質(zhì)細(xì)胞逐漸變化為圓形、胞體大、突起少的活化型小膠質(zhì)細(xì)胞；乙酰谷酰胺各劑量組單位面積Iba-

7、1陽性細(xì)胞數(shù)目較模型組均顯著降低（P＜0.01），形態(tài)上亦有差異。
　　3.中腦黑質(zhì)區(qū)TUNEL染色結(jié)果表明，模型組大鼠黑質(zhì)區(qū)內(nèi)單位面積TUNEL陽性細(xì)胞的比率較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01）而乙酰谷酰胺治療14 d后，中、高劑量組單位面積TUNEL陽性細(xì)胞比率較模型組均顯著降低(P＜0.01)。
　　4.中腦組織蛋白水平的檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠前凋亡誘導(dǎo)因子TARF1的表達水平較假手術(shù)組顯著升高，磷酸化Akt以及Bcl

8、-2/Bax的表達水平顯著降低(P＜0.05)；而乙酰谷酰胺治療14 d后， TRAF1表達水平較模型組顯著降低，磷酸化Akt以及Bcl-2/Bax的表達水平均顯著升高(P＜0.05)。
　　5.皮層區(qū)CD31免疫熒光染色以及VEGF蛋白表達的結(jié)果顯示，模型組大鼠皮層區(qū)微血管數(shù)目較假手術(shù)組顯著增多（P＜0.05），微血管走形紊亂呈迂曲的不規(guī)則形狀。與模型組比較，乙酰谷酰胺三個劑量組的血管密度較模型組也顯著升高(P＜0.05)，微血

9、管分支數(shù)目增多。血管內(nèi)皮細(xì)胞因子VEGF的表達較假手術(shù)組顯著降低，給予不同劑量的乙酰谷酰胺均可以提高VEGF的蛋白表達(P＜0.05)。
　　6.SVZ區(qū)Nestin染色結(jié)果顯示:模型組大鼠Nestin陽性表達較假手術(shù)組顯著升高，而乙酰谷酰胺中、高劑量組的Nestin陽性表達較模型組也顯著升高，并有向梗死灶紋狀體區(qū)域遷移的趨勢。
　　7.1μM和10μM濃度的乙酰谷酰胺對于Na2S2O4誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有明顯的保護作

10、用，表現(xiàn)為與模型組相比，細(xì)胞活性顯著升高(P＜0.05)。10μM的乙酰谷酰胺可以顯著抑制Na2S2O4誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡。
　　8.研究發(fā)現(xiàn)Na2S2O4可造成PC12細(xì)胞和中腦原代神經(jīng)元的線粒體膜電位顯著下降，而乙酰谷酰胺可以明顯改善Na2S2O4對PC12細(xì)胞和中腦原代神經(jīng)元的線粒體膜電位的變化(P＜0.05)。
　　9.體外實驗中，隨著低氧時間的延長，Na2S2O4損傷的PC12細(xì)胞前凋亡誘導(dǎo)因子TRAF1的表

11、達水平逐漸升高；10μM濃度乙酰谷酰胺治療后， TRAF1的表達較模型組減少(P＜0.05)同時能夠促進凋亡通路中的上游蛋白激酶Akt磷酸化(P＜0.01)，提高Bcl-2/Bax的比值（P＜0.05），最終抑制低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　10.TRAF1/DAPI雙染的免疫熒光結(jié)果顯示，在Na2S2O4損傷PC12細(xì)胞中，TRAF1綠色熒光表達水平升高，主要在胞漿中表達；而與模型組比較，10μM濃度的乙酰谷酰胺治療后，發(fā)現(xiàn)TRAF

12、1的綠色熒光表達下降，這與WB的結(jié)果相符。
　　11.Na2S2O4損傷的PC12細(xì)胞中總谷胱甘肽(GSH)含量降低（P＜0.01），而10μM濃度的乙酰谷酰胺可以顯著提高PC12細(xì)胞中GSH的表達(P＜0.05)。
　　第三部分、基于基因芯片檢測技術(shù)對谷紅注射液抗腦缺血作用機制初探
　　1.谷紅注射液可以顯著改善MCAO模型大鼠的運動功能障礙；TH免疫組化結(jié)果顯示，谷紅注射液對黑質(zhì)致密區(qū)TH陽性細(xì)胞有保護作用。

13、>　　2.與假手術(shù)組相比， MCAO模型組大鼠的紋狀體的全基因表達譜芯片共篩選出顯著差異表達基因共1303個，其中上調(diào)的基因985個，下調(diào)的基因318個。經(jīng)過14d給藥治療，與模型組比較，谷紅注射液組有812個基因發(fā)生顯著改變，其中上調(diào)的基因234個，下調(diào)的基因578個。
　　3.通過生物信息學(xué)方法進行的GO分析提示這些基因涉及受體活性、轉(zhuǎn)運體、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞蛋白代謝過程、系統(tǒng)發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育、細(xì)胞分子代謝過程、受體活性、細(xì)胞受