小膠質細胞在熱射病小鼠早期中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥發(fā)生中的作用研究.pdf

1、目的：
　　熱射病(heat stroke：HS)，即重癥中暑，是一種常見的急癥。主要表現(xiàn)為體溫急劇升高，超過40℃，皮膚出現(xiàn)干燥和灼熱，伴有明顯中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損癥狀。重癥患者若未能及時有效控制，則迅速發(fā)展為全身多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），死亡率可達30-50％。近年來，因全球氣候變暖，我國軍人在熱區(qū)進行訓練、野戰(zhàn)演習和執(zhí)行任務時中暑的發(fā)生率明顯增加，往

2、往由于部隊訓練及執(zhí)行任務的地區(qū)條件較艱苦，醫(yī)療水平較為落后，故死亡率更高。因此研究熱射病發(fā)生機理，探索新的治療策略和措施，提高熱射病的救治成功率，對維護軍人以及特殊職業(yè)人群的身體健康，保障部隊的戰(zhàn)斗力具有重要的作用和意義。
　　中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應的發(fā)生及發(fā)展與小膠質細胞密切相關。小膠質細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起到營養(yǎng)、支持、抗原遞呈和組織修護等作用，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應的主要介質，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理和

3、生理過程中起到至關重要的作用。小膠質細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中具有雙重作用。
　　因此，本課題通過建立小鼠熱射病模型，觀察小膠質細胞在熱射病小鼠早期中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥發(fā)生的變化，研究熱射病小鼠腦組織中小膠質細胞活化表型的變化情況，并采用離體細胞模型初步探討熱射病過程中影響小膠質細胞活化表型變化的因素，以揭示小膠質細胞在熱射病中導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應中的作用，為以后臨床上通過采用調節(jié)小膠質細胞活化來救治熱射病提供實驗室依據(jù)。
　

4、　方法:
　　1、采用12周齡的BALB/c12健康雄性小鼠，重量為（29.1±0.6）g，小鼠置于高溫環(huán)境智能模擬實驗艙，溫度（41.2±0.5）℃，相對濕度（60±2）％，加熱至直腸溫度達到（42.4±0.2）℃建立熱射病小鼠模型。將小鼠隨機分為正常對照組(CON)，熱射病組(HS)，熱射病組又分為熱射病1h組(HS-1h)、熱射病3h組(HS-3h)、熱射病6h組(HS-6h)、熱射病12h組(HS-12h)、熱射病24h組

5、(HS-24h)。對比觀察艙室內及出艙后Tre變化和生存率情況，以及不同熱射病組小鼠體質量的變化，利用HE染色觀察大腦組織病理變化。通過實時定量熒光PCR(quantitative rea1-timePCR，qPCR)和酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測各組小鼠大腦皮層及海馬TNF-α、IL-1β和IL-6基因及蛋白表達，探討熱射病后各恢復時相點大腦炎癥的變化情況。

6、r>　　2、通過qPCR檢測各組小鼠大腦皮層M1極性活化標志物CD45、CD16和CD11bmRNA和M2極性活化標志物Arg1（Arginase1，精氨酸酶）、FIZZ(found in inflammatory zone，發(fā)現(xiàn)于炎癥區(qū)域)和CD206mRNA的相對表達水平。Western Blot檢測各組小鼠大腦皮層M1極性活化標志物蛋白CD45、CD11b和M2極性活化標志物蛋白FIZZ、CD206的表達水平。免疫組織熒光觀察M1

7、極性活化標志物CD45和M2極性活化標志物CD206表達情況，探討熱射病后不同時間點大腦皮層小膠質細胞活化表型的表達規(guī)律。
　　3、通過體外培養(yǎng)BV-2小膠質細胞以及BV-2與PC12神經(jīng)細胞transwell共培養(yǎng)的細胞模型，采用熱應激及脂多糖(LPS)刺激，采用ELSA檢測各種條件下培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α、IL-1β的濃度，明確熱應激后小膠質細胞促炎反應的規(guī)律。用q-PCR、流式細胞術以及免疫組織熒光標記觀察各種條件和刺激

8、模型中BV-2小膠質細胞M1極性活化標志物CD11b、CD45和M2極性活化標志物FIZZ、CD206mRNA、蛋白質表達量在不同時間點的相對表達水平揭示熱應激及LPS對單獨或共培養(yǎng)條件下BV-2小膠質細胞活化表型的影響，初步探討對熱射病過程中觸發(fā)小膠質細胞活化的主要機制。
　　結果：
　　1、在（41.2±0.5）℃、濕度(60±2)％環(huán)境中持續(xù)暴露至小鼠Tre達（42.4±0.2）℃建立了小鼠熱射病模型。出艙后HS-1h

9、組小鼠Tre體溫明顯降低，表現(xiàn)為低體溫期，HS-24h組小鼠Tre略高于CON組，表現(xiàn)為發(fā)熱期;HE染色觀察到在熱射病后恢復1h小鼠觀察到細胞周圍水腫、血管周圍水腫、細胞核固縮裂解、內質網(wǎng)紊亂等，其后隨時間延長損傷程度逐步減輕。表明熱應激導致小鼠中樞神經(jīng)細胞出現(xiàn)明顯病理變化，熱射病中樞神經(jīng)損傷小鼠模型成功建立。HS-1h組、HS-3h組小鼠大腦皮層和海馬炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表達及蛋白合成明顯增多，與CON組比較

10、差異明顯(P＜0.0001)，HS-24h組小鼠大腦皮層和海馬炎癥因子與CON組無明顯差異(P＞0.05)。提示熱射病恢復期內中樞神經(jīng)系統(tǒng)有明顯炎癥反應，以恢復期1h最為嚴重，到24h后基本恢復正常水平。
　　2、熱射病小鼠大腦皮層M1極性活化標志物CD45、CD16和CD11b的mRNA表達水平在熱射病恢復后1h迅速升高(P＜0.01)，到24h后mRNA表達水平基本恢復至CON組水平(P＞0.05)。小鼠大腦皮層M2極性活化標

11、志物Arg1、FIZZ和CD206的mRNA表達水平在熱射病恢復3h開始明顯增加(P＜0.001)，后隨時間延長逐漸升高，到24h后達到最高(P＜0.0001)。皮層M1及M2極性活化標志物蛋白表達水平基本與mRNA表達的變化規(guī)律相似。免疫組織熒光觀察M1極性活化標志物CD45，熱射病后恢復1h標記明顯，M2極性活化標志物CD206在熱射病后恢復24h標記明顯。
　　3、熱應激刺激BV-2小膠質細胞后，檢測到到炎癥因子TNF-α、

12、IL-1β含量明顯升高(P＜0.0001)，后逐漸降低，24h后仍然高于對照組(P＜0.0001)。熱刺激后1-3h BV-2小膠質細胞M1極性活化標志物CD45、CD11b mRNA表達水平顯著高于對照(P＜0.0001)，其后略有下降，24h仍維持高表達水平(P＜0.01);而M2標志物CD206、FIZZ mRNA相對表達水平在熱應激后3h出現(xiàn)表達高峰(P＜0.01)，其它時相組與對照無明顯差異(P＞0.05)。流式細胞檢測M1及

13、M2標志物CD45與CD206蛋白質在熱應激1h與24h的表達，結果基本與mRNA相似。免疫熒光觀察到CD45在恢復1h表達增多，至24h基本降低至CON組水平，CD206在恢復1h至24h基本無明顯變化。BV-2小膠質細胞與PC12神經(jīng)細胞transwell共培養(yǎng)的細胞模型，觀察發(fā)現(xiàn)熱應激后小膠質細胞M1極化標志物CD45、CD11bmRNA相對表達水平在1h時表達最高(P＜0.0001)，之后逐漸下降，24h后與對照無明顯差異(P＞

14、0.05)。M2極化標志物FIZZ、CD206mRNA相對表達水平的表達量在在熱應激3-6h開始升高，到24h達到最高(P＜0.0001);流式細胞術檢測M1極化標志物CD45與的M2極化標志物CD206蛋白表達量，其變化趨勢與mRNA基本一致。免疫熒光觀察CD45在恢復1h時少量增加，恢復至24h時降至CON組水平。CD206在恢復1h變化不明顯，恢復至24h增加顯著。LPS刺激后1-3h BV-2小膠質細胞M1極化標志物CD45、C

15、D11bmRNA表達水平明顯升高(P＜0.0001)，24h后達到峰值(P＜0.0001);M2極化標志物CD206在刺激后1-12h變化與對照組比較無明顯差異，M2極化標志物FIZZmRNA相對表達水平在LPS刺激后1-3h變化不明顯，6h-24h反而明顯低于對照組。流式細胞術檢測M1極化標志物CD45及M2標志物CD206蛋白質在熱應激1h與24h的表達，結果與mRNA表達變化基本相似。免疫熒光觀察到CD45持續(xù)增加，至24h達到最

16、高。CD206在1h無明顯變化，至24h降低。
　　結論:
　　1、熱射病后恢復期1h-3h內中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)明顯的炎癥反應，病理損傷最重，之后隨著時間延長逐漸減輕，至24h基本趨于恢復，提示中樞神經(jīng)炎癥與熱射病中樞神經(jīng)損傷密切相關。
　　2、熱射病可誘導小鼠腦組織小膠質細胞活化，其活化的規(guī)律表現(xiàn)為熱射病后1h-3h主要表現(xiàn)為M1型極化，而在熱射病后24h則主要表現(xiàn)為M2型極化，結果表明熱射病后小膠質細胞由M1型向M2