羥基膽固醇在肺腺癌遷移和侵襲中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥致死的主要原因。肺腺癌(ADC)是肺癌的主要常見(jiàn)亞型。其中轉(zhuǎn)移和侵襲是肺腺癌治療中的巨大挑戰(zhàn)。然而，基于轉(zhuǎn)移和侵襲的分子機(jī)制是非常復(fù)雜的并且涉及多種分子和通路。肝X受體(LXRα/NR1H3和LXRβ/NR1H2)是一種核受體，它的作用是作為配體-激活的轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)節(jié)脂代謝和炎癥。LXR可以被天然配體羥基膽固醇類物質(zhì)（如25羥基膽固醇和27羥基膽固醇）激活，也可以被合成的激活劑激活如T09

2、01317(半數(shù)效應(yīng)濃度為50nM)。25羥基膽固醇（25-HC）和27羥基膽固醇(27-HC)是兩種羥基膽固醇類物質(zhì)，是在多種組織器官中由膽固醇羥化酶催化而來(lái)的LXR配體。25-HC是一種有效的LXR介導(dǎo)的通路調(diào)節(jié)劑，參與體內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、炎癥和免疫反應(yīng)。此外，25-HC還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、前列腺癌和前列腺癌異種移植物的細(xì)胞增殖。有研究表明，人體內(nèi)基礎(chǔ)水平的27-HC即能表現(xiàn)出顯著的ER和LXR部分激動(dòng)劑活

3、性。除此之外，27-HC能夠通過(guò)激活受體明顯促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移，但是在黑色素瘤中，LXR的激活能抑制其轉(zhuǎn)移。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在研究25-HC和27-HC是否影響肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并探索其機(jī)制，為臨床肺腺癌治療提供新的依據(jù)。
　　研究方法：
　　實(shí)驗(yàn)本研究中，我們使用人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549或NCL-H1975（上室）和人單核細(xì)胞THP1細(xì)胞（下室）創(chuàng)立了單培養(yǎng)和共培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)羥基膽固醇對(duì)肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。為了

4、排除羥基膽固醇對(duì)細(xì)胞增殖的影響，首先通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估羥基膽羥基膽固醇對(duì)細(xì)胞增殖的影響，為遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)選擇合適的濃度。實(shí)驗(yàn)我們選擇了0.1μM的25-HC、1μM的27-HC和50nM的T0901317用于接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，將ADC細(xì)胞種在6孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，隨后用無(wú)菌的200μL槍頭在單層細(xì)胞上劃出一條約lmm寬的線性劃痕區(qū)。在單培養(yǎng)組中，分別向培養(yǎng)系統(tǒng)中加入上述各種藥物;在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，加入的上清來(lái)自已經(jīng)用藥物作用

5、24小時(shí)的THP1分化的巨噬細(xì)胞。分別與0小時(shí)和24小時(shí)在相應(yīng)位置拍照。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中的ADC細(xì)胞加入上室，含有上述藥物的完全培養(yǎng)基加入下室。根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELI SA)檢測(cè)從單培養(yǎng)和共培養(yǎng)系統(tǒng)中收集的上清液細(xì)胞因子（IL-1β和TGF-β1）含量。最后，使用免疫印跡（Western blotting）分析檢測(cè)蛋白LXR和Snail的表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1.在0.1μM濃度時(shí)，25-

6、HC對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有影響，但是從濃度1μM到25μM，25-HC能抑制兩種肺腺癌細(xì)胞的增殖，并且成劑量依賴性。對(duì)于27-HC，在0.1μM和1μM濃度時(shí)沒(méi)有影響，但在10μM到50μM濃度時(shí)有促進(jìn)作用。T0901317對(duì)于這兩種肺腺癌細(xì)胞增殖均沒(méi)有影響。
　　2.在單培養(yǎng)系統(tǒng)中，羥基膽固醇（0.1μM的25-HC;1μM的27-HC）能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲過(guò)程。在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，兩種肺腺癌細(xì)胞的劃痕愈合過(guò)程都顯著加速。此外，LX

7、R的激動(dòng)劑T0901317與羥基膽固醇有相同的效應(yīng)。
　　3.ELISA結(jié)果顯示，THP1分化的巨噬細(xì)胞在加入羥基膽固醇后減少了IL-lβ和TGF-β1的分泌。有趣的是，在巨噬細(xì)胞和ADC細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，IL-1β的基礎(chǔ)分泌量增加，加入羥基膽固醇后，對(duì)IL-1β釋放產(chǎn)生促進(jìn)作用。這與單培養(yǎng)組的趨勢(shì)完全不同。
　　3.加入羥基膽固醇后，單培養(yǎng)系統(tǒng)中的LXR和Snail表達(dá)量增加，此過(guò)程在共培養(yǎng)系統(tǒng)中更加明顯。
　　4.

8、1L-1β能促進(jìn)兩種ADC細(xì)胞的遷移和侵襲，還能上調(diào)蛋白Snail的表達(dá)，但對(duì)LXR沒(méi)有影響。
　　5.敲除LXR之后顯著抑制兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中25HC介導(dǎo)的Snail表達(dá)，但對(duì)IL-1β介導(dǎo)的Snail表達(dá)沒(méi)有作用。
　　6.敲除LXR后阻斷了25HC引起的ADC細(xì)胞遷移和侵襲，但不影響IL-1β誘導(dǎo)的ADC細(xì)胞的遷移和侵襲。
　　結(jié)論：
　　在這次研究中，我們發(fā)現(xiàn)25-HC在0.1μM濃度時(shí)不影響肺腺癌細(xì)胞增殖;

9、隨著濃度升高，25HC抑制細(xì)胞增殖。除此之外，25HC還能夠在不影響細(xì)胞增殖的情況下促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，尤其是在和THP-1分化的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系中表現(xiàn)更加明顯。與此同時(shí)，25HC的受體LXR的表達(dá)量也相應(yīng)提高。在敲除LXR之后，25HC對(duì)ADC細(xì)胞的遷移和侵襲不再產(chǎn)生促進(jìn)效應(yīng)，且Snail的表達(dá)量也不再升高。以此可得出結(jié)論:25HC可以通過(guò)激活LXR的方式促進(jìn)肺腺癌轉(zhuǎn)移。我們還發(fā)現(xiàn)，25HC都能夠在共培養(yǎng)系統(tǒng)中顯著地刺激IL

10、-1β的分泌，并能增加腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志性蛋白Snail的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β模擬了25HC對(duì)ADC細(xì)胞遷移和侵襲以及Snail蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，敲除LXR后，25HC的這種促進(jìn)效應(yīng)被阻斷，但I(xiàn)L-1β的促進(jìn)作用沒(méi)有受到影響，我們的這些研究結(jié)果表明，25-HC在單一培養(yǎng)中是依賴LXR促進(jìn)ADC細(xì)胞遷移和侵襲的，共培養(yǎng)體系中25-HC誘導(dǎo)的IL-1β分泌能以不依賴LXR的方式加速ADC細(xì)胞遷移和侵襲。
　　27HC的作用結(jié)果