miR-200a在膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究miR-200a在膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲中的作用及其機(jī)制。
　　方法:結(jié)合本課題組前期的研究結(jié)果,利用real-timePCR檢測(cè)miR-200a在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和組織中的表達(dá);將miR-200a的模擬物及抑制劑轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞后,進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn),分別檢測(cè)miR-200a對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響。利用在線miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-200a的靶基因,并用D

2、AVID在線基因功能軟件進(jìn)行歸類分析;利用Westernblot實(shí)驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)所預(yù)測(cè)的潛在靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　結(jié)果:Real-timePCR結(jié)果提示,相對(duì)于低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞,miR-200a在高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中顯著高表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),這與本課題組前期的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞miRNA芯片結(jié)果一致。過(guò)表達(dá)miR-200a可促進(jìn)U87細(xì)胞的遷移侵襲能力(P<0.05),而抑制miR-200a的表

3、達(dá)則結(jié)果相反。過(guò)表達(dá)或抑制miR-200a對(duì)U87細(xì)胞增殖能力均無(wú)顯著影響,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。利用DAVID系統(tǒng)分析Targetscan5.0預(yù)測(cè)的miR-200a潛在靶基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)通路的分布情況,發(fā)現(xiàn)所預(yù)測(cè)的miR-200a潛在靶基因大都涉及到Tightjunction、mTOR等多條與腫瘤遷移侵襲相關(guān)的通路。結(jié)合前期研究及相關(guān)文獻(xiàn),其中值得關(guān)注的抑癌基因有:PTEN、NCAM1、MAP2K4、UBAP1

4、等。
　　Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,在U87細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-200a可下調(diào)PTEN和NCAM1蛋白的表達(dá)水平,抑制miR-200a的表達(dá)則結(jié)果相反。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在U87細(xì)胞中上調(diào)miR-200a的表達(dá)后,AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵分子p-AKT的蛋白表達(dá)升高;抑制miR-200a的表達(dá)后,p-AKT蛋白表達(dá)降低。PTEN是AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要負(fù)性調(diào)控分子,說(shuō)明miR-200a正性調(diào)控AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是通過(guò)調(diào)