Toll樣受體2在膠質(zhì)瘤干細胞侵襲遷移中的作用及其機制探討.pdf

1、膠質(zhì)瘤是人類中樞系統(tǒng)最常見的原發(fā)惡性腫瘤，約占40-60%，局部浸潤性生長是其最重要的生物學特性。目前臨床治療手段主要是手術(shù)最大程度切除腫瘤后進行輔助放、化療，但是治療效果卻十分不理想。臨床治療失敗最根本的原因是膠質(zhì)瘤向正常腦組織的浸潤性生長影響手術(shù)切除程度的精確判斷。因此，對于膠質(zhì)瘤侵襲性生長生物學機制的研究尤為重要。
　　 既往對于Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)功能的研究主要集中在其介導天

2、然免疫及獲得性免疫中發(fā)揮的作用這兩方面，近些年研究發(fā)現(xiàn)TLRs同樣表達于某些腫瘤細胞，且對腫瘤的發(fā)展和演進發(fā)揮重要作用。腫瘤演進是一個涉及腫瘤和宿主多方面的復雜相互作用的過程。其中，腫瘤細胞增殖、凋亡、運動遷移能力、蛋白水解酶釋放等發(fā)生改變均為十分重要的研究內(nèi)容。
　　 最初發(fā)現(xiàn)Toll蛋白表達于果蠅體內(nèi)，是物種進化保留下來的保守序列。TLRs為一類病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular p

3、atterns，PAMPs)，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，是白介素1受體(Interleukin1 receptor，IL-1R)超家族成員，胞外區(qū)是富含亮氨酸的重復序列，胞內(nèi)區(qū)是結(jié)構(gòu)保守的Toll/IL-1受體同源區(qū)(Toll/IL-1 receptorhomologous region，TIR)。迄今為止，在人類和小鼠分別發(fā)現(xiàn)10種和12種功能TLRs，TLR1-TLR9在人類和小鼠細胞均有表達；小鼠TLR10由于反轉(zhuǎn)錄病毒插入而失去功能，但

4、卻發(fā)現(xiàn)了人類細胞不表達的TLR11、TLR12和TLR13。最初發(fā)現(xiàn)TLRs在人體內(nèi)廣泛表達于樹突狀細胞及巨噬細胞等免疫細胞，但近年來的研究表明，TLRs的表達不僅局限于免疫細胞，同樣表達于多種腫瘤細胞，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　 近年提出的“腫瘤干細胞(Cancer stem cells，CSCs)”理論認為，腫瘤中存在少量具有自我更新，多向分化潛能及啟動與重建腫瘤組織表型能力的細胞。但是，這些CSCsTLRs的

5、表達情況，及其對于腫瘤發(fā)展演進的作用與機制尚未見明確報道。
　　 已有文獻報道，膠質(zhì)瘤細胞系GL261表達TLRs，但是表達于膠質(zhì)瘤干細胞(Gliomastem cells，GSCs)的TLRs究竟發(fā)揮何種生物學作用及其可能機制需要進一步探討。為了確定膠質(zhì)瘤細胞GL261上TLRs表達情況，以及探討其是否在GSCs侵襲及遷移中發(fā)揮作用，我們首先對小鼠膠質(zhì)瘤細胞上TLRs表達進行檢測，然后進一步檢測TLR2的表達對于GSCs侵襲遷

6、移能力的影響，及人工合成配體Pam3CS K4激活腫瘤細胞TLR2后，細胞在mRNA水平表達基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase，MMP2)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)的變化情況，我們還觀察了TLR2對于荷瘤小鼠生存時間及腫瘤細胞向鄰近正常組織浸潤程度的影響。主要結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 1.小鼠膠質(zhì)瘤細胞GL261表達TLRs，經(jīng)過干性鑒定的GSCs較GL261細胞侵襲及遷移能力更強，且與GL

7、261細胞相比，GSCs在mRNA和蛋白質(zhì)水平TLR2表達更高。實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，GL261在mRNA水平表達多種TLRs，其中TLR2高表達，TLR3表達水平較高，TLR1、TLR5、TLR7和TLR11則幾乎不表達。運用無血清條件培養(yǎng)基成球培養(yǎng)富集細胞球，并運用免疫熒光染色對其干性進行鑒定，觀察發(fā)現(xiàn)干性標記Nestin、Oligo2及Sox2均強陽性表達。運用半定量、實時熒光定量PCR及Western Blotting的方

8、法，從mRNA及蛋白質(zhì)水平證實，與GL261細胞相比，GSCs高表達TLR2。運用Transwell侵襲和遷移實驗證實GSCs侵襲和遷移細胞數(shù)分別為GL261細胞的1.55倍和1.68倍(p<0.05)。
　　 2.Pam3CSK4可以通過激活小鼠GSCs TLR2以增強其侵襲及遷移能力，其可能機制為Pam3CSK4使GSCs上調(diào)表達MMP2和MMP9。用1μg/ml的TLR2激動劑Pam3CSK4作用于GSCs48h后，tra

9、nswell實驗結(jié)果顯示實驗組侵襲和遷移細胞數(shù)分別為對照組細胞數(shù)的2.23和2.28倍(p<0.05)。經(jīng)實時熒光定量PCR及Western Blotting測定，慢病毒穩(wěn)定干擾TLR2基因表達后，Pam3CSK4促進細胞侵襲及遷移的作用消失。實時熒光定量PCR結(jié)果證實激活TLR2可引起GSCs上調(diào)表達MMP2和MMP9，分別以4h和6h時最顯著，而TLR2沉默表達后，此效應(yīng)消失。
　　 3.TLR2表達對體內(nèi)成瘤的影響。沉默表