骨髓間充質干細胞向膠質瘤遷移的機制研究.pdf

1、目的:
　　 惡性膠質瘤的外科治療中困擾人們的問題足腫瘤殘留、復發(fā)及轉移病灶、衛(wèi)星病灶切除困難,亞臨床病灶難以發(fā)現(xiàn)等等。因此在外科手術的基礎上,針對惡性膠質瘤的放療、化療及生物、基因治療等輔助治療的重要性已為人們所共識。靶向治療具有效果確切,損傷小的特點,但是合適的載體很重要,尋找合適的基因治療載體變得很迫切。骨髓間充質干細胞(BMSCs)是存在于骨髓中的非造血細胞,具有多向分化潛能和定向遷移能力?？烧T導分化為骨、軟骨細胞、脂肪

2、細胞、肌腱、肌肉細胞、神經(jīng)細胞等多種細胞。特別是,骨髓細胞具有向腫瘤的趨化特性,有可能成為理想的基因治療載體。BMSCs定向遷移的機制尚不明確。目前普遍接受的是腫瘤細胞分泌的細胞因子和BMNCs表面表達的受體間的相互作用是促進其趨化遷移的動力。闡明BMSC遷移的機制,有助于提高向腫瘤遷移的效率,可以提高基因靶向治療的效果,同時有利于解釋腫瘤形成的機制。血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)是一類重要的細胞表面粘附分子。它參與調節(jié)白細胞向微

3、血管內皮的遷移及附著。研究表明VCAM-1在BMSC向心血管內皮的遷移中發(fā)揮作用。而VCAM-1在BMSCs向膠質瘤細胞的遷移中具有何種作用目前尚無報道。前期研究發(fā)現(xiàn),血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)是較強烈吸引BMSCs遷移的因子。分析VCAM-1以及PDGF-BB在BMSC趨化遷移中的作用有助于提高其作為基因靶向治療的載體的效率。
　　 本研究首先建立大鼠骨髓間充質干細胞的體外培養(yǎng)體系,并進行相關的表面標志物鑒定。

4、同時利用體外遷移模型探討大鼠骨髓間充質干細胞向膠質瘤細胞條件培養(yǎng)基的趨化遷移能力。在這一過程中,分析VCAM-1在骨髓間充質干細胞的表達情況以及膠質瘤細胞對其表達的調控。然后利用特異性阻斷抗體研究VCAM-1在髓間充質干細胞向膠質瘤的遷移中的作用。然后利用不同濃度的PDGF-BB對骨髓間充質干細胞進行孵育,觀察VCAM-1的表達變化并探討P38,PI3K等信號傳導通路在這一過程中的作用。
　　 材料和方法:
　　 一、骨

5、髓間充質干細胞的體外培養(yǎng)鑒定及向膠質瘤細胞條件培養(yǎng)基的趨化
　　 (一)實驗材料
　　 1、主要試劑:
　　 L-DMEM低糖培養(yǎng)基,胎牛血清,兔抗大鼠CD34、CD44、CD54、CD105多克隆抗體。小鼠抗大鼠CD45多克隆抗體。DAB酶底物顯色試劑盒。75cm2培養(yǎng)瓶(Corning)。主要耗材為Transwell小室(聚碳酸酯膜,孔徑為8um,型號3422,ComingCostar公司)。
　　

6、2、實驗動物
　　 健康雌性SD大鼠,4-6周齡,體重60.809,BMSCs培養(yǎng)原代取材使用,由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。
　　 3、主要儀器
　　 二氧化碳培養(yǎng)箱,倒置顯微鏡,酶標光度儀,精密PH計,電子天平,臺式離心機及超凈工作臺。75cm2培養(yǎng)瓶。Transwell小室。
　　 (二)實驗方法
　　 1、BMSC的原代取材及全骨髓貼壁法進行培養(yǎng)。
　　 2、利用免疫組化及流式細胞

7、技術鑒定BMsCs的表面標志物CD34,CD45,CD44,CD105及CD54,CD90及CD73。
　　 3、培養(yǎng)膠質瘤細胞并制備條件培養(yǎng)基。
　　 4、利用Transwell建立骨髓間充質干細胞體外遷移模型。
　　 二、血管細胞粘附分子-1在骨髓間充質干細胞中的表達及其對遷移的作用
　　 (一)實驗材料
　　 1、主要試劑:
　　 兔抗大鼠VCAM-1多兜隆抗,LY294002,Tr

8、izol,RNAPCRKit(AMV)ver3.0,羅丹明標記的山羊抗兔熒光二抗,RIPA裂解液,小鼠抗大鼠β-actin一抗及二抗。
　　 2、實驗動物
　　 健康雌性SD大鼠,4-6周齡,體重60.809,BMSCs培養(yǎng)原代取材使用,由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。
　　 (二)實驗辦法
　　 1、免疫組織化學及免疫熒光鑒定VCAM-1在BMSCs的表達。
　　 2、C6及U87條件培養(yǎng)基孵育B

9、MSC24小時,免疫熒光、RT-PCR及westernblot測定VCAM-1表達的改變。
　　 3、Transwell體外遷移模型評估阻斷VCAM-1后BMSC遷移變化。
　　 4、免疫熒光、RT-PCR及westernblot測定LY294002對BMSC的VCAM-1表達的影響。
　　 三、血小板衍生生長因子-BB對BMSC的VCAM-1的表達調控
　　 (一)實驗材料
　　 1、主要試劑:

10、
　　 重組PDGF-BB,抑制劑為SB203850,LY294002,SP600125,PD98059及BAY11-7082。兔抗大鼠VCAM-1多克隆抗體,TRizol(Invitrogen)。RNAPCRKit(AMV)ver3.0(Takara)。
　　 2、實驗動物
　　 健康雌性SD大鼠,4-6周齡,體重60.809,BMSCs培養(yǎng)原代取材使用,由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。
　　 (二)實驗

11、方法
　　 l、利用酶聯(lián)免疫反心監(jiān)測膠質瘤細胞培養(yǎng)上清中PDGF-BB的含量。
　　 2、以0,10,20,50,100ng/ml的不通過濃度PDGF-BB孵育BMSCs24小時。
　　 3、免疫熒光、RT-PCR及westernblot測定VCAM-1表達量的改變。
　　 4、50ng/ml濃度的PDGF-BB孵育同時加入SB203850(10μM),LY294002(30μM),SP600125(10

12、μM),PD98059(10μM)及BAY11-7082(5μM)。免疫熒光、RT-PCR及westernblot測定抑制劑對BMSC的VCAM-1表達的影響。
　　 結果:
　　 一、骨髓間充質干細胞的體外培養(yǎng)鑒定及向膠質瘤細胞條件培養(yǎng)基的趨化
　　 1、全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)骨髓間充質干細胞,3天后即可觀察到貼壁細胞,4天以后呈指數(shù)級生長。一周后形成集落,并以集落化方式擴增。大約12-14天生長至80-90%融

13、合。細胞形態(tài)比較均一,呈長梭型,呈旋渦狀、鋪路石狀,生長較密集。
　　 2、BMSC不表達CD34、CD45,陽性表達CD44、CD54、CD105,CD90及CD73。
　　 3、體外遷移實驗證實C6及U87膠質瘤細胞的條件培養(yǎng)基吸引BIdSCs遷移。
　　 二、血管細胞粘附分子-1在骨髓間充質干細胞中的表達及其對遷移的作用
　　 1、免疫組織化學染色及免疫熒光證實BMSC表達VCAM-1。
　　

14、 2、BMSCs向膠質瘤的遷移可因阻斷VCAM-1而受到抑制。
　　 3、免疫熒光、RT-PCR及westernblot證實C6及U87膠質瘤細胞使BMSCs顯著上調表達VCAM-1。
　　 4、加入P13K抑制劑LY294002后,增強的VCAM-1表達受到顯著抑制。
　　 三、血小板衍生生長因子-BB對BMSCs的VCAM-1的表達調控
　　 1、ELISA結果顯示膠質瘤培養(yǎng)上清含有PDGF-BB,

15、平均濃度為6.11ng/L和7.75ng/L。
　　 2、免疫熒光、RT-PCR及Westernblot結果顯示PDGF-BB顯著促進BMSCs表達VCAM-1。
　　 3、10,20ng/ml的PDGF-BB未對BMSCs中VCAM-1的mRNA和蛋白的表達產(chǎn)生有統(tǒng)計學意義的影響,而50,100ng/ml的PDGF-BB顯著上調了BMSCs中VCAM-1的mRNA和蛋白的表達。
　　 4、P13K及P38MAP

16、K,NF-κB的抑制劑SB203850、LY294002及BAY11-7082分別顯著抑制了PDGF-BB誘導的VCAM-1mRNA和蛋白的表達上調。
　　 結論:
　　 1、骨髓間充質干細胞易于體外培養(yǎng)擴增,不表達造血干細胞的標志物CD34及CD45,陽性表達CD44、CD54、CD105、CD90及CD73。具有向C6或U87膠質瘤細胞培養(yǎng)上清的趨化遷移的能力。
　　 2、BMSCs上存在VCAM-1的表達,