整合素α4在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向膠質(zhì)瘤遷移過程中的作用及其相關(guān)機制研究.pdf

1、目的：
　　作為人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，膠質(zhì)瘤由于其侵襲性生長方式，易發(fā)生腦內(nèi)轉(zhuǎn)移的特點，即使采用了手術(shù)輔以放、化療的綜合治療方案，患者預(yù)后仍然不理想。近年來，越來越多的學(xué)者對膠質(zhì)瘤的治療提出了新的方案——靶向性基因治療。靶向性基因治療是在某一載體中導(dǎo)入功能基因，并對腫瘤細(xì)胞進行靶向定位，從而定向攻擊腫瘤細(xì)胞。目前在靶向性基因治療研究中最受研究者關(guān)注的問題之一是如何選擇合適的載體。繼以病毒載體之后，有研究報道可以利用干細(xì)

2、胞的趨瘤特性將其作為治療性基因的載體。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstem cells，MSCs)是一種來源于中胚層的成體干細(xì)胞。因MSCs具有組織來源多樣和向膠質(zhì)瘤定向遷移的特點，使其可能成為膠質(zhì)瘤靶向治療較為理想的載體。在眾多來源的MSCs中，骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)因其可自體取材，易于體外擴增等特點而得到越來越多研究者的青睞。Integrinα4作為整合素家族的一個成員，可以在細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮重要的作用，并且

3、已被證實參與調(diào)控白細(xì)胞等免疫細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移。
　　本研究中我們首先建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系并對所獲得細(xì)胞的表面標(biāo)志物和多向分化能力進行鑒定;其次利用傷痕愈合實驗和Transwell體外遷移模型來研究BMSCs向膠質(zhì)瘤細(xì)胞定向遷移以及integrinα4在這一過程中的作用;并進一步運用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、免疫熒光、蛋白免疫印跡(westernblot)技術(shù)研究膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基對BMSCs表達(dá)integrinα4的影

4、響;最后利用PI3K，NF-κB，MEK，p38MAPK和JNK信號通路的特異性抑制劑探討調(diào)控膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)BMSCs對integrinα4表達(dá)變化以及BMSCs定向遷移過程中所可能涉及的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。
　　實驗材料和方法：
　　一、實驗材料
　　1、主要試劑:
　　DMEM低糖培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，兔抗大鼠CD34、CD45、CD73、CD90、CDl05多克隆抗體（北京博奧森），int

5、egrinα4單克隆抗體(Abcam)，75cm2培養(yǎng)瓶和Transwell小室(Corning)。SB203850(Enzo)，LY294002(CellSignalingTechnology),SP600125(Enzo), PD98059(Enzo)及BAY11-7082(Enzo),TRizol(Life technologies), RNA PCR Kit(AMV) ver3.0(TaKaRa), SYBR PremixEx

6、TaqTMII Kit(TaKaRa)。羅丹明標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗（北京博奧森），RIPA裂解液(Sigma)，小鼠抗大鼠GAPDH單克隆一抗(Santa Cruz)，山羊抗小鼠HRP二抗(Santa Cruz)。Transwell小室(聚碳酸酯膜，孔徑為8μm，型號3422，ComingCostar)。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo Scientific)。
　　2、實驗動物
　　BMSCs培養(yǎng)原代取材使用4-6周齡

7、健康雌性SD大鼠，體重60-80g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。
　　3、主要儀器
　　細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Forma scientific公司）;超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;倒置顯微鏡（日本TMS公司）;熒光顯微鏡（日本Olympus公司）;紫外-可見光分光光度計（日本島津公司）;FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）;超聲粉碎機（德國Hielscher公司）;臺式低溫超速離心機（美國Sigma公司）;

8、聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置（美國Bio-Rad公司）;轉(zhuǎn)印儀（北京市六一儀器廠）;Las3000成像系統(tǒng)（日本Fujifilm公司）;凝膠成像分析軟件（江蘇捷達(dá)科技有限公司）;電子分析天平（德國Sartorius公司）;-80℃超低溫冰箱（日本Sanyo公司）;恒溫震蕩水浴（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）;旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。
　　二、實驗方法
　　1、全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs。
　　2、流式細(xì)胞術(shù)

9、鑒定BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物。
　　3、鑒定原代培養(yǎng)獲得的BMSCs具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化的能力。
　　4、利用Transwell小室建立體外遷移模型評價BMSCs向膠質(zhì)瘤的定向遷移。
　　5、傷痕愈合實驗評價膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基孵育對BMSCs遷移能力的影響。
　　6、RT-PCR和免疫熒光法評估integrinα4在BMSCs的表達(dá)。
　　7、MTS檢測膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基對BMSCs增殖的影響

10、。
　　8、膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基孵育BMSCs24小時后，利用RT-PCR、免疫熒光及western blot檢測integrinα4表達(dá)的改變。
　　9、流式細(xì)胞術(shù)檢測膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基對BMSCs細(xì)胞周期的影響。
　　10、體外遷移模型評估integrinα4在BMSCs向膠質(zhì)瘤遷移過程中的作用。
　　11、膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基孵育同時分別加入SB203850（10μM），LY294002（30μM），SP600125

11、（10μM），PD98059（10μM）及BAY11-7082（5μM），RT-PCR及western blot測定上述抑制劑對膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)BMSCs表達(dá)integrinα4變化的影響。
　　12、膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基孵育同時加入BAY11-7082（5μM），利用Transwell體外遷移模型和傷痕愈合實驗?zāi)Ｐ驮u估BAY11-7082對BMSCs向膠質(zhì)瘤遷移能力的影響。
　　13、數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0軟件。所有

12、實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較用One-way ANOVA檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　一、大鼠BMSCs的分離鑒定
　　1、原代培養(yǎng)骨髓細(xì)胞4天后，鏡下可見貼壁細(xì)胞;P1，P2，P3代細(xì)胞可見細(xì)胞呈長梭形，旋渦狀生長。
　　2、經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)所獲得的P3代BMSCs CD34(陽性率1％)，CD45（陽性率0.966％）表達(dá)呈陰性，同時CD73（陽

13、性率98.7％），CD90（陽性率99.1％），CD105（陽性率98.3％）表達(dá)呈陽性。
　　3、用P3代BMSCs進行成骨，成脂，成軟骨三系分化實驗。誘導(dǎo)分化后的BMSCs分別對礦結(jié)節(jié)染色、脂肪油滴染色和膠原蛋白染色呈陽性表達(dá)，證實所獲得的BMSCs具有向成骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，軟骨細(xì)胞分化的能力。
　　二、阻斷integrinα4抑制BMSCs向膠質(zhì)瘤的定向遷移
　　1、傷痕愈合實驗結(jié)果顯示在膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基孵育下B

14、MSCs遷移能力明顯增強。
　　2、Transweil體外遷移模型中，在下室內(nèi)加入膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)孵育，BMSCs可以發(fā)生定向遷移，證實BMSCs具有向膠質(zhì)瘤定向遷移的能力。
　　3、Integrinα4單克隆阻斷抗體明顯抑制了BMSCs向膠質(zhì)瘤的定向遷移。
　　三、膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基上調(diào)BMSCs對integrinα4的表達(dá)
　　1、RT-PCR證實膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基促進BMSCs對integrinα4 mRNA的表

15、達(dá)
　　2、免疫熒光實驗結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基可以上調(diào)BMSCs對integrinα4的表達(dá)。
　　3、Western blot證實膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基明顯增加了BMSCs對integrinα4的表達(dá)
　　四、NF-κB，PI3K通路參與由膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的BMSCs對integrinα4上調(diào)表達(dá)過程的調(diào)控
　　1、NF-κB和PI3K通路抑制劑可以明顯抑制膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)BMSCs對integrinα4的

16、上調(diào)表達(dá)。
　　2、JNK、p38MAPK、MEK通路抑制劑對膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的integrinα4上調(diào)表達(dá)無明顯抑制作用。
　　五、NF-κB是調(diào)控BMSCs向膠質(zhì)瘤定向遷移的相關(guān)信號分子
　　傷痕愈合實驗、Transwell遷移模型實驗結(jié)果提示NF-κB通路抑制劑BAY11-7082可以明顯減弱BMSCs向膠質(zhì)瘤的遷移。
　　結(jié)論：
　　1、Integrinα4參與了BMSCs向膠質(zhì)瘤定向遷移過程的調(diào)控，膠質(zhì)