阿維菌素抗膠質(zhì)瘤作用及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤，其惡性程度高、發(fā)病率高，病人預(yù)后差。化療作為治療惡性腫瘤的一個(gè)重要手段，然而藥物使用一段時(shí)間后，絕大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞都會(huì)產(chǎn)生耐藥性，從而導(dǎo)致化療的失敗。根據(jù)美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)統(tǒng)計(jì)，在死亡的病人當(dāng)中有90％以上的人存在耐藥性，由FDA批準(zhǔn)的治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤化療藥物中替莫唑胺由于其全身毒副作用小，可以很好的透過血腦屏障，被廣泛用臨床一線當(dāng)中。但腫瘤細(xì)胞也不可避免的對(duì)其產(chǎn)生了耐藥性，

2、所以篩選和研發(fā)增敏替莫唑胺殺傷作用的藥物是很有必要的。阿維菌素（avermectins，AVMs）是由阿維鏈霉菌產(chǎn)生的一類大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。AVMs通常是用來治療寄生蟲感染等疾病，主要是通過觸殺和胃毒作用來發(fā)揮對(duì)害蟲的毒殺效果。研究發(fā)現(xiàn)AVMs可以抑制P-糖蛋白對(duì)其底物的外排作用，從而降低腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性。本課題組在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)AVMs對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞、膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖均有明顯抑制作用，且可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其作用機(jī)

3、制尚未明確。本文就以膠質(zhì)瘤U87、U251和T98細(xì)胞為研究對(duì)象，探討AVMs抗腫瘤的作用機(jī)制，為阿維菌素抗腫瘤新藥研發(fā)及其臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
　　第一部分 阿維菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制研究
　　研究目的:
　　研究阿維菌素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.分別用不同濃度的AVMs（0、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM）處理膠

4、質(zhì)瘤兩種細(xì)胞系(U87和U251)不同時(shí)間（24、48、72小時(shí)），采用MTT法檢測(cè)AVMs對(duì)細(xì)胞增殖的影響;
　　2.不同濃度的AVMs（0、4μM、8μM）處理細(xì)胞72小時(shí)后，用AnnexinⅤ-FITC/PI染色膠質(zhì)瘤細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀下檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況;
　　3.不同濃度的AVMs（0、4μM、8μM）處理細(xì)胞72小時(shí)采用JC-1法染色各組細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位;
　　4.不同濃度的AVMs(0

5、、4μM、8μM)處理細(xì)胞72小時(shí)后，提取總RNA反轉(zhuǎn)錄并采用Real-time PCR檢測(cè)bcl-2、bax、caspase3mRNA表達(dá)水平;
　　5.不同濃度的AVMs（0、4μM、8μM）處理細(xì)胞72小時(shí)后，提取總蛋白，用Western blotting檢測(cè)bcl-2、bax、caspase3蛋白表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.AVMs對(duì)膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞增殖有抑制作用，并呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性;

6、r>　　2.AVMs可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞的凋亡，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組凋亡率均增加了(P＜0.05);
　　3.AVMs可以U87和U251細(xì)胞的線粒體跨膜膜電位，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組紅/綠熒光強(qiáng)度比均增加了(P＜0.05);
　　4.PCR和Western bloting結(jié)果提示:AVMs可以促進(jìn)U87和U251細(xì)胞中caspase3、bax mRNA和蛋白分子的表達(dá)水平(P＜0.01)，同時(shí)降低bcl2mRNA和

7、蛋白分子的表達(dá)水平(P＜0.01)。
　　研究結(jié)論:
　　1.AVMs具有抑制膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞增殖的作用;
　　2.AVMs可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可能是與觸發(fā)線粒體凋亡途徑有關(guān)。
　　第二部分 阿維菌素對(duì)替莫唑胺殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響及相關(guān)機(jī)制研究
　　研究目的:
　　研究阿維菌素對(duì)替莫唑胺殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響及其相關(guān)機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.分

8、別用MTT法檢測(cè)AVMs、TMZ以及AVMs+TMZ對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤三種細(xì)胞系（U87、U251和T98）增殖的影響，測(cè)出它們的IC50;
　　2.采用Chou-Talalay法評(píng)估AVMs與TMZ的聯(lián)合效應(yīng);
　　3.不同濃度的AVMs（0、4μM、8μM）處理細(xì)胞72小時(shí)后，采用RT-PCR檢測(cè)ABCB1、ABCG2以及MGMTmRNA分子表達(dá)水平;
　　4.不同濃度的AVMs(0、4μM、8μM)處理細(xì)胞72小時(shí)后

9、，采用Western blotting檢測(cè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCB1、ABCC1、ABCG2)以及MGMT蛋白分子表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.AVMs、TMZ以及AVMs+TMZ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖均有抑制作用，并呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性;
　　2.AVMs+TMZ在IC50的時(shí)候?qū)87、U251以及T98細(xì)胞的CI（聯(lián)合指數(shù)）分別為:0.85、0.72、0.34;
　　3.RT-PCR和Western blo