復(fù)方中藥合劑抗HCMV感染陽(yáng)性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞作用及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　1.觀察該復(fù)方中草藥合劑在體外對(duì)HCMV感染的U251膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GSCS）增殖及凋亡的影響。
　　2.探討該復(fù)方中草藥合劑及聯(lián)合更昔洛韋在體內(nèi)對(duì)HCMV感染的U251GSCS移植瘤的生長(zhǎng)及其血管生成的影響。
　　方法：
　　1.根據(jù)莪術(shù)、冬凌草、白花蛇舌草抗病毒抗腫瘤特性制備抗膠質(zhì)瘤復(fù)方中草藥配方，將三種中草藥提取物溶于培養(yǎng)基中，制備不同濃度的復(fù)方中草藥合劑。
　　2.用HCMV AD169

2、毒株感染人胚肺成纖維細(xì)胞（HELF）進(jìn)行病毒擴(kuò)增，并用空斑定量法測(cè)HCMV滴度。
　　3.用單克隆培養(yǎng)法從U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中分離出GSCs，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)U251GSCS中CD133+細(xì)胞的比例。
　　4. U251GSCS接種HCMV（MOI=1），實(shí)驗(yàn)組加入不同藥物濃度復(fù)方中草藥合劑，對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后，用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活性。
　　5.用RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中HCMV基因IE-

3、1、抑制凋亡基因Bcl-2及促進(jìn)凋亡基因Bax mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)各組Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的情況。
　　6.將感染HCMV的U251GSCS移植到裸鼠顱內(nèi)14d后，將裸鼠隨機(jī)分為復(fù)方中草藥合劑組、更昔洛韋組、復(fù)方中草藥合劑聯(lián)合更昔洛韋組及空白對(duì)照組。采用灌胃給藥的方式治療裸鼠，14天后處死裸鼠，取出腦組織中的腫瘤組織做病理檢查。
　　7.用免疫組化檢測(cè)腫瘤中IE-1、CD34蛋白表達(dá)，并計(jì)算腫

4、瘤微血管密度（MVD），RT-PCR檢測(cè)腫瘤中Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1. U251GSCS在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞呈球形，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，U251GSCS中CD133+細(xì)胞數(shù)達(dá)95%以上。
　　2. MTT結(jié)果顯示，復(fù)方中草藥合劑可抑制細(xì)胞增殖，隨著復(fù)方中草藥合劑濃度及作用時(shí)間的增加，HCMV感染的U251GSCS活性降低（P＜0.05）。
　　3.軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5、表明，該復(fù)方中草藥合劑可明顯抑制HCMV感染的U251 GSCS的克隆形成，且隨著藥物濃度的增加，抑制效果越明顯（P＜0.01）。
　　4. RT-PCR結(jié)果顯示，HCMV感染的U251GSCS與不同濃度復(fù)方中草藥合劑培養(yǎng)48h后，細(xì)胞內(nèi)促凋亡基因Bax mRNA的表達(dá)量增加，HCMV基因IE-1和抑凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)量減少（P＜0.05）。
　　5. Western blot結(jié)果顯示，HCMV感染的U251

6、GSCS在不同濃度復(fù)方中草藥合劑作用48h后，Bax蛋白表達(dá)量隨著藥物濃度的增加而增多，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)量隨著藥物濃度的增加而減少（P＜0.05）。
　　6.復(fù)方中草藥合劑和更昔洛韋均能減少HCMV感染的U251GSCS移植瘤微血管的生成（P＜0.05），聯(lián)合用藥抑制移植瘤微血管生成較單獨(dú)用藥組效果明顯，二者無(wú)交互作用（P＞0.05）。
　　7. RT-PCR結(jié)果顯示，復(fù)方中草藥合劑和更昔洛韋能抑制移植瘤細(xì)胞內(nèi)Bcl-2

7、 mRNA的表達(dá)（P＜0.05），并促進(jìn)Bax mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。聯(lián)合用藥組Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于復(fù)方中藥組、更昔洛韋組和對(duì)照組（P＜0.05），聯(lián)合用藥組Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于復(fù)方中藥組、更昔洛韋組和對(duì)照組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.該復(fù)方中草藥合劑在體外能抑制HCMV感染的U251GSCS的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。
　　2.該復(fù)方中草藥合劑可通過(guò)抑制腫瘤血管生成、誘導(dǎo)