與臍血多能干細(xì)胞共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞對(duì)阿爾茲海默病小鼠的免疫炎性調(diào)節(jié)及治療作用.pdf

1、研究背景
　　阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，其主要的病理學(xué)改變?yōu)棣?淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積及過(guò)度磷酸化tau蛋白引起的神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）。AD的臨床癥狀包括認(rèn)知功能障礙（記憶力下降為一突出表現(xiàn)），社會(huì)生活能力下降，言語(yǔ)功能障礙，人格改變等。通過(guò)AD的發(fā)病年齡可將其分為早發(fā)型阿爾茲海默病和晚發(fā)型阿

2、爾茲海默病。目前認(rèn)為65歲前發(fā)病的為早發(fā)型阿爾茲海默病，該類型多為家族遺傳性病變，患者往往具有與AD發(fā)病呈正性相關(guān)的突變基因，但此類型在所有AD中所占比例較少。晚發(fā)型阿爾茲海默病是AD的主要類型，患者多于65歲以后發(fā)病。隨著人口老齡化程度的不斷加劇，AD的發(fā)病率不斷上升，且隨著病情的不斷進(jìn)展，AD患者會(huì)逐漸失去生活自理能力，這給家庭及社會(huì)帶來(lái)了巨大的負(fù)擔(dān)。目前，藥物治療是臨床上AD的唯一治療方法，其主要原理為增加腦內(nèi)興奮性遞質(zhì)，但該方法

3、也僅限于延緩病情進(jìn)展，并不能阻止病情的進(jìn)展和逆轉(zhuǎn)相關(guān)癥狀。因此，研究開(kāi)發(fā)對(duì)AD的新型治療途徑是很有必要的。目前關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說(shuō)，包括:Aβ沉積學(xué)說(shuō)、tau蛋白異常磷酸化毒性學(xué)說(shuō)等。有學(xué)者提出由于在人的老齡化過(guò)程中所受到的氧化應(yīng)激不斷積累及各種體內(nèi)外穩(wěn)態(tài)失衡引起的系統(tǒng)性炎性反應(yīng)和腦內(nèi)炎癥反應(yīng)及其誘發(fā)的體內(nèi)免疫反應(yīng)可能是AD起病及病情進(jìn)行性加重的重要因素。臍血多能干細(xì)胞(Cord-blood stem cells,CB-SCs)

4、是一種較為新型的多能干細(xì)胞，具有免疫調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的功能及分型，且不具有技術(shù)和倫理限制。本研究將與CB-SCs共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注射移植入阿爾茲海默病小鼠體內(nèi)，對(duì)其作用及效果進(jìn)行初步觀察。
　　研究方法
　　1.臍血多能干細(xì)胞的制備
　　采集健康產(chǎn)婦的臍帶血，將其加入含有單核細(xì)胞分離液的離心管中，采用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞，然后加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞。分離出的細(xì)胞種植于Petri培養(yǎng)皿中培

5、養(yǎng)。
　　2.淋巴細(xì)胞制備
　　無(wú)菌條件下分離出阿爾茲海默病模型小鼠的脾臟，研磨，制備出細(xì)胞懸液，將其加入淋巴細(xì)胞分離液，分離出淋巴細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求將淋巴細(xì)胞與臍血多能干細(xì)胞共培養(yǎng)或是單獨(dú)進(jìn)行培養(yǎng)。
　　3.阿爾茲海默病小鼠的處理
　　將與CB-SCs共培養(yǎng)或單獨(dú)培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注入阿爾茲海默病小鼠體內(nèi)，每月1次，連續(xù)注射4個(gè)月。
　　4.行為學(xué)測(cè)定
　　末次注射結(jié)束2周后，進(jìn)行Morris

6、水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察小鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶能力。
　　5.外周血血漿與淋巴細(xì)胞標(biāo)本采集
　　行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完成后，乙醚麻醉小鼠，內(nèi)眥靜脈采集小鼠外周血，4℃條件下離心，分離出血漿，凍存。重懸細(xì)胞沉淀，將其加入淋巴細(xì)胞分離液中，分離出淋巴細(xì)胞。
　　6.流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)
　　向培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞及分離出的小鼠外周血淋巴細(xì)胞加入相應(yīng)流式抗體:anti-Mouse APC-conjugated CD4, anti-Mouse PE-co

7、njugated CD25,4℃條件下避光孵育30min，固定破膜后加入anti-Mouse PE-Cy7-conjungated Foxp3抗體，4℃條件下避光孵育30min，檢測(cè)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞所占比例。
　　7.ELISA
　　每組取3只小鼠進(jìn)行心臟灌流，于冰上快速取腦，分離海馬與皮層，液氮凍存。稱取皮層組織0.1g，加入900uL PBS制成10％的腦組織勻漿，于4℃離心機(jī)中4000r/min，離心20min，取上清

8、，用ELISA試劑盒檢測(cè)上清及血漿中的TNF-α，TGF-β1，IL-10，IL-1β炎性因子含量。
　　8.免疫熒光染色
　　每組取3只小鼠進(jìn)行心臟灌流固定，取腦后于4％多聚甲醛中在4℃條件下過(guò)夜后固定，30％蔗糖過(guò)夜脫水后制作15um冰凍切片。進(jìn)行免疫熒光染色。
　　9.PCR檢測(cè)腦組織內(nèi)炎性因子含量
　　通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腦組織內(nèi)炎性因子基因表達(dá)。使用Qiagen試劑盒提取小鼠腦組織內(nèi)總mRNA

9、，根據(jù)TAKALA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將單鏈RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。以AB17300HT Fast Real-Time PCR system進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，以GAPDH作為內(nèi)參。
　　10.TUNEL染色
　　根據(jù)TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，對(duì)小鼠腦組織切片進(jìn)行染色，染色結(jié)束后于普通熒光顯微鏡下觀察。
　　研究結(jié)果
　　1.靜脈注射與CB-SCs共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞組阿爾茲海默病小鼠表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)及記憶能力的

10、改善
　　通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，靜脈注射與CB-SCs共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞組AD小鼠（實(shí)驗(yàn)組）其空間探索時(shí)間較注射單獨(dú)培養(yǎng)淋巴細(xì)胞組AD小鼠（對(duì)照組）下降明顯。且實(shí)驗(yàn)組小鼠穿過(guò)目的象限的次數(shù)(6.667±0.88)及在目的象限的探索時(shí)間（17.6±2.111 s）均大于對(duì)照組的穿越平臺(tái)次數(shù)(3.667士0.33)和目的象限探索時(shí)間（11.77士1.185 s）(P＜0.05)。
　　2.通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)

11、靜脈注射與CB-SCs共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞的阿爾茲海默病小鼠外周血淋巴細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)含量升高
　　流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與CB-SCs共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞即調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)比例高于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　3.ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)靜脈注射與CB-SCs共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞可調(diào)節(jié)阿爾茲海默病小鼠外周及腦內(nèi)的炎性反應(yīng)
　　通過(guò)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)

12、驗(yàn)組小鼠外周血血漿中的促炎因子TNF-α(P＜0.001)和IL-1β(P＜0.01)含量較對(duì)照組明顯降低，而其血漿中的抗炎因子IL-10(P＜0.05)和TGF-β1(P＜0.01)含量高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組腦組織勻漿中的TNF-α含量高于對(duì)照組(P＜0.001)，而IL-10，IL-1β濃度差趨勢(shì)雖與血漿相同，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)靜脈注射與CB-SCs共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組小鼠腦內(nèi)Aβ沉積量降低，而iba-1

13、+的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目升高
　　通過(guò)腦組織切片的免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織內(nèi)Aβ沉積量低于對(duì)照組(P＜0.05)，而iba-1+小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量大于對(duì)照組(P＜0.05)。且在融合圖像中發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中iba-1+小膠質(zhì)細(xì)胞更傾向于圍繞在Aβ沉積斑塊周?chē)?br>　　5.實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn)靜脈注射與CB-SCs共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞可起到調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)組小鼠腦內(nèi)炎性因子mRNA表達(dá)量作用
　　通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小鼠腦組織內(nèi)促炎因子(TN

14、F-α，IL-1β)及抗炎因子(IL-10，TGF-β1)的mRNA表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織內(nèi)TNF-α，IL-1β的mRNA表達(dá)量低于對(duì)照組，而IL-10，TGF-β1表達(dá)量高于對(duì)照組。(P＜0.05)
　　6.TUNEL一步法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射與CB-SCs共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞可改善小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡情況
　　通過(guò)TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組小鼠腦皮層和海馬中的凋亡神經(jīng)元比對(duì)照組明顯減少。(P＜0.01)
　　結(jié)論<