臍帶血多能干細(xì)胞對帕金森氏病的治療潛能.pdf

1、研究背景
　　 帕金森氏病是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，該病主要病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元脫失。多巴胺能神經(jīng)元在控制人體隨意運(yùn)動和調(diào)節(jié)姿勢位置中起著關(guān)鍵作用。迄今為止，藥物對帕金森氏病的治療還極為有限，只能在一定程度上改善癥狀，不能阻止疾病的進(jìn)展。因此仍需研究尋找一種新的治療方法，能夠長期有效地控制癥狀，甚至從根本上治愈帕金森氏病。干細(xì)胞是一類有自身再生能力的細(xì)胞，可以分化成不同來源的組織，補(bǔ)充損傷及老化的組織細(xì)胞，這為治療

2、帕金森氏病提供了可能的途徑。人臍血來源干細(xì)胞與其他種類的干細(xì)胞相比具有特殊的優(yōu)勢:(1)來源充足(2)不牽涉?zhèn)惱韱栴}(3)對捐贈者無明顯損傷(4)不容易產(chǎn)生移植物抗宿主反應(yīng)。其中一類新的臍血干細(xì)胞種類被稱為臍血多能干細(xì)胞。這類細(xì)胞具有胚胎細(xì)胞的特性，有多向分化潛能。臍血多能干細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的研究領(lǐng)域已有一定的相關(guān)研究，已經(jīng)證明，通過使用神經(jīng)生長因子可以誘導(dǎo)其分化為神經(jīng)元細(xì)胞。而全反式維甲酸是已經(jīng)證明的可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞形成，軸突生

3、長和促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元分化的有效誘導(dǎo)劑。本研究通過采用全反式維甲酸誘導(dǎo)臍血多能干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化，探索臍血多能干細(xì)胞在治療帕金森氏病中的作用。
　　 研究方法
　　 1.臍血多能干細(xì)胞的制備
　　 在捐贈者的新鮮臍帶中收集臍帶血，加入淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，加入紅細(xì)胞分離液分離出紅細(xì)胞。分離出單個(gè)核細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　 2.細(xì)胞分化
　　 臍血多能干細(xì)胞在生長至70％匯合時(shí)

4、在神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)分別加入5μmol/L及10mol/L全反式維甲酸進(jìn)行培養(yǎng)，并設(shè)陰性及陽性對照。誘導(dǎo)12天后檢測細(xì)胞特異性標(biāo)記物和多巴胺。
　　 3.實(shí)時(shí)定量PCR
　　 采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測多巴胺神經(jīng)元特異性標(biāo)記物的mRNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。使用Qiagenkit(Valencia，CA)提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)QuantiTectReverseTranscriptionkit(Qiangen，Valencia

5、，CA)說明書將總RNA合成為單鏈cDNA。以ABIPrism7900HTFastReal-TimePCR系統(tǒng)(AppliedBiosystems，CA)對每例樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測。基因特異性PCR引物由SABiosciences(Frederick，MD)公司設(shè)計(jì)并合成。結(jié)果以β-actin作為內(nèi)參。
　　 4.Westernblot分析
　　 為確定多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況，我們采用Westernbl

6、ot進(jìn)行分析。細(xì)胞充分清洗后用預(yù)冷PBS洗滌，加入裂解液溶解蛋白，離心，蛋白樣本與上樣緩沖液混合，煮沸。上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜。分離后的蛋白用脫脂奶粉封閉，分別與Nurr1，En1和Wnt1Abs抗體孵育。以β-actin為內(nèi)參。
　　 5.免疫細(xì)胞化學(xué)
　　 全反式維甲酸處理的臍血多能干細(xì)胞及對照組細(xì)胞采用4％多聚甲醛固定，用0.5％TritonX100破膜，封閉，分別與抗酪氨酸羥化酶抗體，抗多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體抗體，抗神經(jīng)細(xì)胞核抗

7、體，抗角質(zhì)蛋白酸性纖維抗體，抗βⅢ微管蛋白抗體，抗微管結(jié)合蛋白2抗體等一抗孵育。充分清洗后與相應(yīng)熒光素標(biāo)記二抗孵育，采集圖像并進(jìn)行分析。
　　 6.多巴胺酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
　　 采用全反式維甲酸處理12天后檢測處理組與對照組多巴胺的釋放。細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗，分別加入含5.33mmol/L及56mmol/L鉀離子的Hank's平衡鹽溶液。5分鐘后測定細(xì)胞上清液內(nèi)多巴胺的含量。
　　 研究結(jié)果
　　

8、 1.臍血多能干細(xì)胞有向多巴胺神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能:
　　 臍血多能干細(xì)胞由多人的臍帶血制備而成。為評估臍血多能干細(xì)胞向多巴胺神經(jīng)元的分化，我們檢測了多巴胺特異神經(jīng)元Nurr1、Wnt1和En1等特異轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示未處理組中臍血多能干細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Nurr1，Wnt1，andEn1等mRNA。Westernblot分析進(jìn)一步表明三種蛋白均有表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR也表明臍血多能干細(xì)胞內(nèi)酪氨酸羥化酶mRNA表達(dá)水平較

9、低。而酪氨酸羥化酶是催化酪氨酸合成二羥多巴胺的關(guān)鍵酶。這些結(jié)果表明臍血多能干細(xì)胞有向多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能。
　　 2.通過全反式維甲酸誘導(dǎo)可使臍血多能干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞:
　　 通過實(shí)驗(yàn)我們評估了兩種濃度全反式維甲酸對臍血多能干細(xì)胞的影響。5μmol/L與10μmol/L這兩種濃度均可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變，向神經(jīng)元分化。而全反式維甲酸的濃度越高，則向神經(jīng)元分化的細(xì)胞比例越大。大多數(shù)細(xì)胞(90％)在經(jīng)過1

10、0μmol/L全反式維甲酸處理5-8天后表現(xiàn)出典型的神經(jīng)元的形態(tài)，當(dāng)處理后10-12天，這一變化更加明顯，細(xì)胞形成更長的分枝狀突起。當(dāng)以5μmol/L全反式維甲酸處理10-12天后有35％細(xì)胞分化形成神經(jīng)元細(xì)胞樣形態(tài)，但形成軸突較短。在神經(jīng)元培養(yǎng)基對照組中大多數(shù)細(xì)胞(＞95％)沒有表現(xiàn)出向神經(jīng)元細(xì)胞的分化。而在無血清培養(yǎng)基內(nèi)，臍血多能干細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)后仍然是圓形，無明顯形態(tài)改變。
　　 通過免疫染色顯示神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物微管蛋白

11、βⅢ、微管結(jié)合蛋-2、成熟神經(jīng)元標(biāo)志物抗原、膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物角質(zhì)蛋白酸性纖維等。結(jié)果顯示全反式維甲酸誘導(dǎo)后90±4％細(xì)胞微管蛋白βⅢ、微管結(jié)合蛋-2表達(dá)明顯增強(qiáng);70±7％細(xì)胞經(jīng)全反式維甲酸誘導(dǎo)后成熟神經(jīng)元標(biāo)志物抗原表達(dá)陽性;只有少數(shù)細(xì)胞表達(dá)角質(zhì)蛋白酸性纖維(5±2％)。在神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基對照組中約有(5％)細(xì)胞表達(dá)微管蛋白βⅢ、微管結(jié)合蛋-2、成熟神經(jīng)元標(biāo)志物抗原、膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物角質(zhì)蛋白酸性纖維等。這些結(jié)果證明通過使用10μmol/L全反

12、式維甲酸誘導(dǎo)臍血多能干細(xì)胞可使其分化成為神經(jīng)元樣細(xì)胞。
　　 3.經(jīng)全反式維甲酸誘導(dǎo)后臍血多能干細(xì)胞分化成功能性多巴胺能神經(jīng)元，并刺激后可釋放多巴胺:
　　 我們通過免疫熒光的方法檢測多巴胺能神經(jīng)元特異性蛋白，包括酪氨酸羥化酶和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體。結(jié)果顯示:經(jīng)全反式維甲酸處理后約48±11％的細(xì)胞表達(dá)酪氨酸羥化酶;36±9％的細(xì)胞表達(dá)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體。而在神經(jīng)培養(yǎng)基血清對照組中僅有少量細(xì)胞(5±1％)表達(dá)酪氨酸羥化酶和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體

13、。結(jié)果證明通過全反式維甲酸誘導(dǎo)可以使臍血多能干細(xì)胞分化成為多巴胺能神經(jīng)元。
　　 通過細(xì)胞外鉀離子刺激導(dǎo)致細(xì)胞去極化，檢測經(jīng)全反式維甲酸誘導(dǎo)后臍血多能干細(xì)胞是否會釋放多巴胺。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測結(jié)果顯示以10μmol/L全反式維甲酸處理組的細(xì)胞，經(jīng)鉀離子刺激后細(xì)胞外多巴胺水平顯著升高(P＜0.001)。結(jié)果證明采用10μmol/L全反式維甲酸處理后臍血多能干細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化為有功能的釋放多巴胺的神經(jīng)元樣細(xì)胞。