LINC02154在卵巢癌順鉑耐藥中的初步研究.pdf

1、在婦科惡性腫瘤中，死亡率位居首位的為卵巢癌。在所有癌癥死因的女性患者中死亡率也高居第五位。全世界每一年約有220,000女性被診斷為卵巢上皮性癌(EOC)，美國2014年就有21,980位女性患者被診斷為卵巢癌，并有14,270名患者死于卵巢癌。在我國，卵巢癌發(fā)病同樣高居不下，據(jù)統(tǒng)計，2009-2011年期間，我國卵巢癌新發(fā)病率為52.1‰，死亡率為22.5‰，治療前景堪憂。
　　因卵巢癌尚無特異性強的早期篩查方法，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時

2、已是晚期或終末期。化學(xué)藥物治療對于晚期卵巢癌患者來說是主要手段，然則有效的卵巢癌化療藥物較少。根據(jù)NCCN的指南，卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)化療方案基本是基于鉑類和紫杉醇兩種，其中鉑類藥物特別是順鉑占據(jù)的比重更大。臨床患者中，通過鉑類藥物化療，大部分患者病情可緩解，但化療藥物多療程應(yīng)用，有部分病人可能對鉑類藥物產(chǎn)生耐藥，甚至導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)，而約30％患者對鉑類基礎(chǔ)藥物化療根本無應(yīng)答。鉑類藥物耐藥作用的產(chǎn)生導(dǎo)致患者化療效果降低，成為卵巢癌治療的重大阻礙。

3、
　　鉑類耐藥可能由多種機制產(chǎn)生，其成因包括：包括：阻斷凋亡途徑、增強DNA損傷修復(fù)能力、內(nèi)外環(huán)境變化、減少腫瘤細(xì)胞攝取藥物、增強細(xì)胞解毒等。盡管已經(jīng)有了非常多的相關(guān)研究，并沒有解決鉑類藥物的耐藥問題，在臨床上的應(yīng)用進(jìn)展不大。但是，由于順鉑在卵巢癌治療中的特殊地位，其耐藥問題一直作為一個卵巢癌研究的關(guān)鍵問題而存在，并且值得我們持續(xù)地研究和探索。
　　長非編碼RNAs（lncRNAs）代表了一類新的非編碼蛋白質(zhì)的RNAs，超過

4、200個nt，存在于真核生物中，不作為蛋白質(zhì)合成的模板。以前的研究已經(jīng)表明lncRNAs在癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用[5]，可使癌細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。最近，lncRNA研究相對較新的領(lǐng)域，主要集中在癌癥診斷和治療中的價值。事實上，已經(jīng)有研究表明lncRNAs可能作為診斷的分子標(biāo)記物，預(yù)后與腫瘤對治療的反應(yīng)的預(yù)測。
　　盡管已有證據(jù)表明LncRNA參與調(diào)控多種腫瘤的耐藥作用，但是有關(guān)LncRNA參與卵巢癌順鉑耐藥的文章較少，

5、且研究的也不夠深入。我們將在本研究中探討新的與卵巢癌順鉑耐藥關(guān)系更確切的LncRNA并深入研究其功能。
　　目的：
　　1.篩選卵巢癌耐藥相關(guān)的關(guān)鍵lncRNAs分子；
　　2.對關(guān)鍵lncRNAs分子在卵巢癌組織中的表達(dá)進(jìn)行驗證；
　　3.探討關(guān)鍵lncRNAs分子表達(dá)改變后，對卵巢癌順鉑藥物敏感度的影響；
　　方法：
　　1.利用qRT-PCR技術(shù)結(jié)合Arraystar LncRNA芯片結(jié)果，驗證

6、一組LncRNA分子在兩對卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞系及其親本細(xì)胞系中差異表達(dá)，篩選出目標(biāo)LncRNA D32即LINC02154；
　　2.利用qRT-PCR技術(shù)在人卵巢組織中檢測LINC02154表達(dá)，并采用Kaplan-Meier方法分析LINC02154表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理特點以及預(yù)后的關(guān)系；
　　3.構(gòu)建設(shè)計合成pEX-2/LINC02154真核過表達(dá)質(zhì)粒，通過瞬時轉(zhuǎn)染，CCK-8法細(xì)胞增殖實驗、qRT-PCR技術(shù)、人

7、卵巢腫瘤組織移植裸鼠成瘤實驗、動物體內(nèi)轉(zhuǎn)染實驗、順鉑鼠尾靜脈注射藥效實驗等方法驗證LINC02154表達(dá)改變后，對細(xì)胞及組織功能影響。
　　結(jié)果：
　　1.通過qRT-PCR檢測，獲得一組LncRNA分子，LncRNA D5、LncRNA D9、LncRNA D12.1、LncRNA D13、LncRNA D25、LncRNA D32在A2780/CP70細(xì)胞株及SKOV3/SKOV3-DDP細(xì)胞株中的結(jié)果與LncRNA芯片

8、一致。其中LncRNA D32差異最為顯著。經(jīng)序列比對，LncRNAD32在NCBI數(shù)據(jù)庫和GENCODE數(shù)據(jù)庫中命名為:LINC02154或GS1-600G8.5，編碼基因定位于X染色體的短臂22區(qū)2帶，位置為13,266,048-13,303,452。LncRNAD32是由該基因編碼的長度為927bp的非編碼RNA。實驗發(fā)現(xiàn)其在卵巢癌順鉑敏感/耐藥細(xì)胞株中表達(dá)存在差異，在順鉑敏感細(xì)胞株中高表達(dá)，在順鉑耐藥細(xì)胞株中低表達(dá)。
　　

9、2.LINC02154在正常及良性卵巢腫瘤組織中的表達(dá)均一，在卵巢癌中表達(dá)紊亂，差異明顯，其在卵巢癌中表達(dá)差異與卵巢癌患者預(yù)后相關(guān)，低表達(dá)LINC02154的卵巢癌病人總生存期較高表達(dá)LINC02154的卵巢癌病人短，預(yù)后較差，這一結(jié)果與LINC02154的耐藥特征一致。
　　3.LINC02154表達(dá)升高可促進(jìn)卵巢癌耐藥細(xì)胞及小鼠PDX模型中卵巢癌組織對順鉑的敏感性。
　　CCK-8細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示過表達(dá)LINC021

10、54可提高卵巢癌耐藥細(xì)胞株CP70對順鉑敏感性。動物體內(nèi)轉(zhuǎn)染LINC02154后鼠尾靜脈注射順鉑的藥效實驗結(jié)果也顯示經(jīng)染轉(zhuǎn)后的小鼠卵巢癌移植瘤體積縮小率最高，對順鉑更敏感，與體外實驗結(jié)果一致。
　　結(jié)論：通過對lncRNA芯片結(jié)果的驗證，我們首次發(fā)現(xiàn)了一組卵巢癌順鉑耐藥相關(guān)lncRNAs分子，而LINC02154可能是這組分子中影響卵巢癌順鉑耐藥性狀的關(guān)鍵lncRNA分子；并發(fā)現(xiàn)其表達(dá)差異與卵巢癌患者預(yù)后具有一定相關(guān)性。通過體外C