fmo同源基因在綠僵菌生長、發(fā)育及致病過程中的作用研究.pdf

1、黃素單加氧酶(monooxygenaseFAD-binding，F(xiàn)MO)普遍存在于哺乳動物組織的內質網，能廣泛的氧化含硫和含氮的外源性物質，代謝有毒或者致癌性物質，有解毒功能。然而目前對FMO在絲狀真菌中的作用尚不清楚，本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，綠僵菌中有一fmo同源基因在綠僵菌侵染宿主后在宿主體內能高表達，可能與侵染毒力相關。研究綠僵菌fmo（Mafmo）基因功能不僅有助于進一步明確真菌的致病機制，同時也為篩選新的抗真菌藥物或高毒力菌

2、株提供理論依據(jù)。本研究運用基因敲除技術構建Mafmo敲除載體獲得穩(wěn)定的敲除菌株(ΔMafmo)，分析了Mafmo基因對綠僵菌侵染毒力、生長發(fā)育及抗逆性的影響。
　　主要研究內容：
　　1.Mafmo序列的生物信息學分析
　　從實驗室構建的綠僵菌在宿主體內特異表達基因的差減文庫中選擇編號為CJY1439的EST序列,在NCBI上進行Blastx比對，分析該序列與其他基因的同源性；采用nucleotideblasts搜索出

3、CJY1439對應的基因組序列；用GENSCAN1.0和GeneMark預測其氨基酸序列。
　　2.獲得Mafmo基因的敲除菌株
　　設計引物，從野生型綠僵菌Ma102基因組DNA中擴增出Mafmo的左、右臂DNA片段，分別插入pK2-PB載體Bar基因的5端或3端，構建Mafmo的敲除載體。采用農桿菌介導轉化法產生Mafmo基因的敲除菌株。通過PCR分析和Southernblotting的方法鑒定Mafmo基因的敲除菌株。

4、
　　3.Mafmo基因的功能分析
　　⑴Mafmo基因對毒力的影響
　　將Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鮮孢子配制成的孢懸液，分別采用體內注射或體表侵染兩種途徑研究Mafmo敲除菌株與野生型菌株對宿主毒力的作用。通過觀察經過兩種途徑處理后宿主的死亡時間，分析半致死時間的變化，以明確Mafmo基因對毒力的影響。
　?、芃afmo基因在綠僵菌侵染中的作用
　　①Mafmo基因對綠僵菌在宿主血腔中生長的影響<

5、br>　　活體觀察：將Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鮮孢子配制成的孢懸液通過體內注射宿主后，取宿主血液觀察蟲菌體數(shù)量。
　　離體觀察：取新鮮的宿主血液，去除或不去除血細胞，分別接種Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鮮孢子配置成的孢懸液，觀察孢子萌發(fā)、生長情況。
　?、贛afmo基因在綠僵菌侵染初期的作用
　　孢子萌發(fā)及附著胞形態(tài)的觀察：將Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鮮孢子配制成的孢懸液分別接種于宿主后翅，觀察孢子萌

6、發(fā)及侵染結構附著胞的形成時間，分析兩者之間是否存在差異。
　?、荕afmo基因對綠僵菌抗逆生長的影響
　　在高滲透壓（0.4MKCl，1M山梨醇，1M甘露醇）、高氧化劑（30％H2O2）、細胞壁干擾劑（50μg/mL熒光增白劑，500μg/mL剛果紅，0.01%十二烷基磺酸鈉）或缺氧條件下培養(yǎng)Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鮮孢子配制成的孢懸液，觀察其在形態(tài)、產孢量、生物量積累的差異。
　　主要研究結果：
　　1

7、.EST序列編號為CJY1439，長度710bp。Blastx比對發(fā)現(xiàn)CJY1439對應的基因組序列與monooxygenaseFAD-binding(FMO)有同源性，因此將此基因命名為Mafmo。該基因編碼193個氨基酸，分子量為21.8kDa，等電點pI為8.14，不含有信號肽。
　　2.通過PCR分析和Southernblotting鑒定，證實獲得了4個穩(wěn)定的Mafmo敲除菌株（△Mafmo1、△Mafmo3、△Mafmo

8、5、△Mafmo6）。
　　3.Mafmo基因的功能分析結果：
　?、派锒玖y定結果顯示：體內注射孢懸液后，Mafmo敲除菌株較野生型菌株對宿主的半致死時間顯著提前（Mafmo敲除菌株對宿主的半致死時間為：△Mafmo3的為3.83±0.10d；△Mafmo5的為3.59±0.13d；△Mafmo6的為3.23±0.21d，野生型菌株對宿主的半致死時間為：4.99±0.17d）；體表侵染孢懸液后，Mafmo敲除菌株和野生型

9、菌株二者對宿主的的半致死時間沒有顯著差異。結果表明Mafmo基因影響綠僵菌的毒力。
　?、脾倩铙w血液培養(yǎng)結果顯示：野生型菌株或Mafmo敲除菌株新鮮孢子配制成的孢懸液通過體內注射進入宿主體內后，取宿主血液觀察發(fā)現(xiàn)Mafmo敲除菌株較野生型菌株產生的蟲菌體不僅出現(xiàn)的早且多，數(shù)量差異顯著；離體血液培養(yǎng)結果顯示：全血培養(yǎng)36h時間后，野生型菌株較Mafmo敲除菌株在菌體數(shù)上要少，差異顯著；用不含血細胞的血液離體培養(yǎng)，野生型菌株與Mafm

10、o敲除菌株在菌體數(shù)上無顯著差異。②將Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鮮孢子配制成的孢懸液分別接種于宿主后翅上，20h時野生型菌株的萌發(fā)率顯著高于Mafmo敲除菌株；二者的附著胞相對形成率卻沒有顯著差異。即Mafmo影響綠僵菌在宿主體表的萌發(fā)不影響其附著胞的形成。
　　以上①、②表明：Mafmo基因不僅在綠僵菌進入宿主血腔后具有功能活性，還影響了綠僵菌侵染初期的生長發(fā)育。
　　⑶在高滲透壓、高氧化劑、干擾劑和缺氧條件下培養(yǎng)Ma