乳酸脫氫酶的克隆表達及酶學性質的研究.pdf

1、苯乳酸(PLA)是一種新型生物防腐劑，乳酸脫氫酶(LDH)是乳酸菌(LAB)中轉化苯丙酮酸(PPA)生成苯乳酸的主要酶。根據(jù)已知的植物乳桿菌WCFS1全基因組序列可知，植物乳桿菌有三個乳酸脫氫酶基因，分別為ldhL1、ldhL2、ldhD，三個基因的酶產(chǎn)物分別為：L1-乳酸脫氫酶、L2-乳酸脫氫酶和D-乳酸脫氫酶。
　　 本研究根據(jù)L.plantarum WCFS1的三個乳酸脫氫酶基因設計引物，并以植物乳桿菌SK002全基因組D

2、NA為模版，PCR擴增并連接到pMD-19簡易T載體。測序結果表明：植物乳桿菌SK002 ldhL1基因長度為963 bp； ldhD(Gene bank登錄號FJ712706)基因長度為999 bp；ldhL2基因長度為930 bp。將三個基因連入表達載體，并導入大腸桿菌BL21(DE3)中，成功誘導表達并純化出三種重組乳酸脫氫酶。三種酶的蛋白分子量分別為35、34、40 kDa。測定三種重組酶對底物苯丙酮酸的活性，發(fā)現(xiàn):L2-LDH

3、對苯丙酮酸的比活力僅為0.06U/mg； L1-LDH為71.06 U/mg，是L2-LDH的1000多倍；D-LDH比活力為215.84 U/mg。故重點研究L1-LDH和D-LDH的酶學性質。L1-LDH酶活測定的最適pH為6.0，溫度為40℃:D-LDH最適pH為6.0，溫度為30℃；L1-LDH的pH穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性均好于D-LDH。在各自的最適測定酶活條件下，測定兩種酶對丙酮酸及苯丙酮酸的Km。L1-LDH對丙酮酸及苯丙酮酸K