CAT、SOD在肝缺血再灌注損傷大鼠小腸內的表達變化.pdf

1、肝缺血再灌注損傷（hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）是肝膽外科臨床實踐中常見并發(fā)癥。HIRI的發(fā)生不僅增加肝移植術后的死亡率和發(fā)病率，還導致病人恢復延遲和愈后較差。研究發(fā)現(xiàn):在缺血再灌注過程中會產(chǎn)生大量ROS(reactive oxygen species:ROS)，這些ROS可引起嚴重微循環(huán)障礙。因此，由ROS引發(fā)的氧化應激被認為與HIRI的發(fā)生發(fā)展有密切關聯(lián)。
　　機體內存在多種

2、抗氧化系統(tǒng)，其中超氧化物歧化酶(superoxidedismutases，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)是這個防御系統(tǒng)的關鍵抗氧化酶。它們通過清除代謝反應中產(chǎn)生的ROS來保護機體免受氧化應激損傷。
　　小腸缺血再灌注損傷是小腸移植，循環(huán)性休克和絞窄性腸梗阻等疾病發(fā)生發(fā)展過程中非常常見的臨床問題。研究發(fā)現(xiàn):小腸缺血再灌注損傷會導致肝臟結構和功能的嚴重損害。反之，當肝臟缺血再灌注損傷發(fā)生，是否會使小腸結構和功能也產(chǎn)生

3、嚴重改變？氧化應激是否也是導致這種損害的重要因素？抗氧化酶SOD和CAT的表達如何改變，是否發(fā)揮抗氧化作用？
　　本實驗首先制造大鼠HIRI模型;再灌注6小時后檢測血清過氧化氫(H2O2)水平、丙二醛(MDA)水平;小腸組織內H2O2水平、MDA水平，CAT和SOD基因及蛋白表達水平。觀察HIRI發(fā)生后小腸組織形態(tài)學改變和氧化應激水平，探討CAT和SOD清除小腸組織過多ROS的抗氧化作用。
　　目的:
　　觀察肝缺血再

4、灌注損傷模型小腸組織形態(tài)結構的改變，小腸組織內氧化應激狀態(tài)以及是否遭受過氧化損傷，抗氧化酶CAT和SOD基因及蛋白表達水平，探討HIRI誘導小腸組織過氧化損傷機制，抗氧化酶CAT和SOD清除小腸組織過多ROS的抗氧化作用，為尋求預防和治療HIRI誘發(fā)的小腸組織損傷提供數(shù)據(jù)參考。
　　方法:
　　1.大鼠分組、HIRI模型制備及檢測材料處理
　　12只體重200±10g的雄性Wistar大鼠隨機分為對照組(Con)和模型

5、組(HIRI)。根據(jù)Kohli等人的操作步驟建立HIRI模型:按照0.5ml/kg的劑量腹腔注射6％水合氯醛麻醉大鼠，分離膽管蒂和肝血管，血管夾阻斷供應肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂。30分鐘后再次恢復肝臟血液循環(huán)，建立大鼠HIRI模型。對照組大鼠只分離但不夾閉膽管蒂和血管。肝臟血液供應重新恢復6小時后取血分離血清，用于肝功能指標丙氨酸氨基轉移酶(ALT)活性、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)水平、丙二醛(malo

6、ndialdehyde，MDA)水平檢測;取大鼠肝臟和小腸中部，部分4％多聚甲醛固定，用于觀察肝臟和小腸組織形態(tài)學改變(HE染色法)，其余部分置于液氮，用于小腸組織內H2O2含量、MDA含量，抗氧化酶CAT和SOD mRNA水平和蛋白水平的表達變化。
　　2.檢測指標及測定方法
　　2.1 血清ALT、H2O2含量、MDA含量測定
　　全自動生化分析儀測定血清ALT水平;鉬酸比色法測定血清H2O2水平;硫代巴比妥酸比色

7、法測定血清MDA水平。
　　2.2 大鼠肝臟和小腸組織形態(tài)結構觀察
　　采用HE染色法觀察肝臟和小腸組織形態(tài)學變化。
　　2.3 大鼠小腸組織勻漿液MDA含量測定
　　小腸組織勻漿液中MDA含量采用南京建成測定試劑盒檢測（硫代巴比妥酸比色法）。
　　2.4 大鼠小腸組織勻漿液H2O2含量測定
　　小腸組織勻漿液中H2O2含量采用南京建成測定試劑盒檢測（鉬酸比色法）。
　　2.5 大鼠小腸組織CA

8、T、SOD基因水平檢測
　　RT-PCR法測定大鼠小腸組織CAT、SOD基因水平。以目的基因CAT和SOD擴增條帶灰度值與GAPDH擴增條帶灰度值之比代表CAT和SODmRNA的相對表達量。
　　2.6 大鼠小腸組織CAT、SOD蛋白水平檢測
　　免疫印跡法(Western blot)檢測小腸組織CAT、SOD蛋白水平。雙色紅外線成像系統(tǒng)觀察條帶并分析其灰度值。
　　結果:
　　1.大鼠肝臟、小腸組織形態(tài)結

9、構變化
　　對照組大鼠肝細胞整齊排列呈條索狀，并放射狀分布在中央靜脈周圍，肝血竇大小平均，無擴張充血。而HIRI組肝細胞表現(xiàn)為受壓萎縮和嚴重淤血，肝血竇呈明顯的充血擴張，且肝細胞胞漿內可見空泡，HE顏色變淺，部分肝細胞出現(xiàn)水腫，體積增大。但HIRI組和對照組小腸組織的形態(tài)結構未見明顯區(qū)別。
　　2.血清ALT活性
　　HIRI組大鼠血清ALT活性（87.43±9.06 U/L）明顯高于Con組大鼠血清ALT活性(20.

10、03±5.23U/L)。P＜0.01
　　3.血清H2O2含量
　　HIRI組大鼠血清H2O2含量（23.28±4.19μmol/L）明顯高于Con組大鼠血清中H2O2含量（13.52±2.19μmol/L）。P＜0.01
　　4.血清MDA含量
　　HIRI組大鼠血清MDA含量（17.54±1.96 umol/L）明顯高于Con組大鼠血清中MDA含量（12.69±2.29 umol/L）。P＜0.01
　

11、　5.小腸組織勻漿內MDA含量
　　HIRI組大鼠小腸組織勻漿MDA含量(23.97±3.42 mmol/g)明顯高于Con組大鼠小腸組織勻漿MDA含量（15.94±2.24mmol/g），P＜0.01。
　　6.小腸組織勻漿內H2O2含量
　　HIRI組大鼠小腸組織勻漿H2O2含量(36.69±5.98 mmol/g)明顯高于Con組大鼠小腸組織勻漿H2O2含量(25.98±4.08mmol/g)，P＜0.01。

12、r>　　7.小腸組織CAT和SOD mRNA表達水平
　　RT-PCR法測定大鼠小腸組織CAT和SOD mRNA表達水平。HIRI組大鼠小腸組織CAT(0.55±0.09)和SOD(0.85±0.13) mRNA表達水平明顯高于Con組小腸組織CAT(0.38±0.07)和SOD(0.63±0.11) mRNA表達水平，P＜0.01，表明:HIRI組大鼠小腸組織CAT和SOD基因表達水平增強。
　　8.小腸組織CAT和SOD

13、蛋白表達水平
　　Western blot法測定大鼠小腸組織CAT和SOD蛋白表達水平。HIRI組大鼠小腸組織CAT(0.59±0.08)和SOD(0.91±0.12)蛋白表達水平明顯高于Con組小腸組織CAT(0.37±0.06)和SOD(0.67±0.13)蛋白表達水平，P＜0.01，表明:HIRI組小腸組織抗氧化關鍵酶CAT、SOD蛋白水平是明顯增加的。
　　結論:
　　1.小腸組織的形態(tài)結構在HIRI后雖未出現(xiàn)