EC-SOD在大鼠肝缺血再灌注損傷模型肺內的表達變化.pdf

1、肝臟作為機體內最大的腺體，不僅參與了糖類、脂類、蛋白質等物質的代謝，還具有排泄、分泌、生物轉化等重要功能。因此，當肝臟功能出現(xiàn)損傷時，不僅機體內的物質代謝會發(fā)生紊亂，其他重要器官的功能也會出現(xiàn)障礙。臨床上的肝臟手術如肝臟移植、肝部分切除術等的實施過程中均需要暫時性阻斷肝臟的血液供應，但當其血液供應被重新恢復時即會發(fā)生肝缺血再灌注損傷（hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）。因此， HIRI已成

2、為臨床肝臟外科治療過程中的主要并發(fā)癥。它的發(fā)生也是引發(fā)肝臟手術患者出現(xiàn)手術失敗、肝功能衰竭，以及術后愈后較差的主要原因。
　　實驗研究表明，肝臟被阻斷的血供被重新恢復時即會有大量活性氧族（reactive oxygen species：ROS)的產生，高活性分子ROS對肝臟組織細胞引發(fā)的過氧化損害是導致HIRI發(fā)生的主要機制之一。ROS的成員主要包括超氧陰離子（O2-.）,過氧化氫（H2O2）和羥自由基(OH.)等。ROS能與細胞

3、內的重要蛋白質、酶、核酸、細胞骨架及脂質物質發(fā)生過氧化反應，導致線粒體功能障礙和胞膜結構受損，甚至組織和細胞的死亡。肺臟是機體內對氧氣供應量和缺氧狀態(tài)非常敏感的臟器。在缺血再灌注氧氣供應量發(fā)生變化時，肺臟是否也會發(fā)生氧化應激反應，遭受過氧化損傷？
　　超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutases，SOD）是機體內重要的抗氧化酶之一，它能催化O2-氧化生成氧和H2O2。因此，SOD是清除O2-的重要酶蛋白，在機體內的抗

4、過氧化過程具有重要作用。哺乳動物體內共有三中SOD亞型：在線粒體內以錳作為輔基的錳-超氧化物歧化酶（Mn-SOD），在細胞胞漿中以銅和鋅作為輔基的銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)。細胞外超氧化物歧化酶（extracellular SOD, EC-SOD)是機體內唯一位于細胞外的SOD亞型，它依靠自身的肝素結合域( heparin-binding domain, HBD)能與細胞外基質和細胞表面結合。以往眾多的抗氧化功能研究主要集

5、中于Cu/Zn-SOD和Mn-SOD。但也有實驗研究發(fā)現(xiàn)：細胞外的EC-SOD在機體內的抗氧化應激和抗炎反應中可能發(fā)揮了更重要的作用。HIRI可引起其他臟器的損傷，包括遠隔臟器心、腦、肺等。這些遠隔臟器的損傷與炎癥、氧化應激、凋亡等密切相關。EC-SOD在肺臟組織內大量表達，在HIRI發(fā)生后，肺組織遭受損傷時，肺組織內的抗氧化酶EC-SOD基因和蛋白表達如何變化，在缺血再灌注后是否發(fā)揮了抗氧化應激作用，有待研究。
　　本研究通過阻

6、斷大鼠肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂再重新恢復其灌注的方法制造大鼠HIRI模型，然后測定大鼠肺組織內的MDA和H2O2水平變化，以及EC-SOD的mRNA和蛋白表達改變。探討HIRI發(fā)生后肺組織內的氧化應激狀態(tài)以及EC-SOD在此過程中的抗氧化應激作用。
　　目的：
　　觀察大鼠HIRI模型肺組織內的MDA水平、H2O2水平以及抗氧化酶EC-SOD的基因和蛋白表達水平變化，探討HIRI發(fā)生后肺組織內的氧化應激狀態(tài)以及EC-SO

7、D在此過程中可能發(fā)揮的抗氧化作用。
　　方法：
　　1、大鼠HIRI模型的制備及標本處理
　　選用體重190-210g健康雄性Wistar大鼠12只，實驗動物均購于河北醫(yī)科大學實驗動物。將大鼠隨機分為HIRI組（6只），Conrol組（6只）。采用自配的6％水合氯醛（0.5ml／kg）對大鼠進行腹腔注射麻醉。按照Kohli等人的實驗方法，用自制的手術玻璃針小心分離膽管和肝血管，分離出通往肝左葉和肝中葉的血管以及膽管蒂，

8、并采用無損傷血管夾夾閉。夾閉30分鐘后撤去血管夾，重新恢復肝中葉和肝左葉的血液灌注，制造70%的肝實質HIRI模型。Conrol組大鼠被麻醉后，只分離通往肝中葉和肝左葉的血管及膽管蒂，30分鐘后關閉大鼠腹腔?；謴透闻K血液供應6小時后再次重新將其麻醉，首先收集大鼠血液，用于血清 ALT（丙氨酸氨基轉移酶）和MDA含量檢測；取大鼠肝臟和肺臟，將肝臟置于4%多聚甲醛溶液中固定，采用HE染色法觀察大鼠肝組織形態(tài)結構的改變；將大鼠肺臟置于液氮中，

9、用于抗氧化酶 EC-SOD的基因水平和蛋白水平檢測，以及肺組織內MDA含量和H2O2含量檢測。
　　2、測定指標及檢測方法
　　2.1、 HE染色觀察大鼠肝臟形態(tài)結構的改變
　　肝組織經梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋處理后，進行切片，切片厚度約5μm，采用蘇木精伊紅進行染色， Olympus光學顯微鏡觀察大鼠肝臟組織形態(tài)結構的變化。
　　2.2、大鼠血清ALT活性檢測
　　收集的大鼠血液未進行抗凝處理，

10、靜置30分鐘后，3000rpm離心10min，收集血清，采用全自動生化分析儀測定ALT活性。
　　2.3、大鼠血清MDA含量檢測
　　大鼠血清內MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)測定試劑盒測定。
　　2.4、大鼠肺組織勻漿制備以及MDA含量檢測
　　從-80℃冰箱中取出HIRI組和Control組大鼠肺組織，按照10mg/100μl的處理比例，加入4℃勻漿緩沖液(PH7.4，磷酸鉀緩沖液50mmol/L， P

11、MSF1mmol/L，鹽酸苯甲脒1mmol/L，NaCl0.5mol/L，0.1%Tween-20，β-巰基乙醇5mmol/L，EDTANa31mmol/L)，冰浴下進行勻漿處理，勻漿液于4℃，4000rpm離心20分鐘，收集上清即制成10％肺組織勻漿，勻漿內MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)測定試劑盒進行檢測。
　　2.5、大鼠肺組織H2O2含量檢測
　　將從-80℃冰箱中取出的肺組織按照10mg/100μl比例加入預

12、冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，PH7.4，1mmol/L鹽酸苯甲脒，1mmol/L PMSF，0.1%Tween-20，0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTANa3，5mmol/Lβ-巰基乙醇)，冰浴下進行勻漿處理，勻漿液于4℃，4000rpm離心20分鐘，收集上清即制成10％肺組織勻漿。肺組織勻漿內H2O2含量采用鉬酸比色法進行檢測，以每克樣本蛋白所含H2O2量(mmol/g pro)表示肺組織H2O2含

13、量。
　　2.6、大鼠肺組織EC-SOD mRNA表達水平檢測
　　采用 TRIzol試劑提取大鼠肺組織總 RNA，并反轉錄生成 cDNA。GAPDH作為內參照，RT-PCR法測定EC-SOD mRNA表達水平。EC-SOD擴增產物的灰度值與內參照GAPDH擴增產物灰度值之比，表示目的基因EC-SOD的相對表達水平。
　　2.7、大鼠肺組織EC-SOD蛋白表達水平檢測
　　采用免疫印跡法測定大鼠肺組織EC-SOD

14、的蛋白表達水平。將-80度冷凍的大鼠肺組織制成勻漿液,離心后取上清，并做蛋白變性處理。蛋白總量采用改良 Lorry法進行測定。電泳蛋白上樣量為62ug。經過電泳、轉膜及封閉處理后,在 PVDF膜上加入兔抗 EC-SOD一抗,室溫靜置過夜。經過洗膜處理后，加入抗兔IgG二抗（辣根過氧化物酶標記）。按發(fā)光試劑操作指導先后進行顯影、定影、晾干處理。掃描膠片并進行圖像分析， EC-SOD灰度值與內參照GAPDH灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水

15、平。
　　結果：
　　1、大鼠肝臟組織HE染色形態(tài)學觀察
　　奧林巴斯光學顯微鏡下，對照組大鼠肝組織切片顯示：肝細胞排列整齊形成條索狀，圍繞在中央靜脈周圍成放射狀排列，肝血竇大小均勻未見擴張充血。肝缺血再灌注損傷組大鼠肝組織切片顯示：肝細胞有受壓萎縮現(xiàn)象，并且淤血嚴重，肝血竇擴張充血比較明顯，肝細胞的胞漿內有空泡出現(xiàn)，HE染色變淺，可見部分肝細胞水腫，體積有所增大。
　　2、大鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶活性改變

16、r>　　對照組大鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶為20.03±5.23U/L，而肝缺血再灌注損傷組大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶為87.43±9.06 U/L。肝缺血再灌注損傷組大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶水平明顯高于對照組（P<0.01）。
　　3、大鼠血清中丙二醛含量變化
　　對照組大鼠血清中丙二醛的含量為12.69±2.29 umol/L，肝缺血再灌注損傷組大鼠血清中丙二醛的含量為17.54±1.96 umol/L。肝缺血再灌注損傷組大

17、鼠血清丙二醛含量明顯高于對照組（P<0.01）。
　　4、大鼠肺勻漿內丙二醛含量變化
　　HIRI組大鼠肺內丙二醛含量（14.09±2.47 mmol/g）明顯高于對照組大鼠肺內丙二醛含量（9.81±1.89mmol/g， P<0.01）
　　5、肺勻漿內H2O2含量變化
　　HIRI組大鼠肺內H2O2含量（19.52±3.03 mmol/g）明顯高于Con組大鼠肺內H2O2含量（13.39±1.97mmol/g

18、）（P<0.01）。
　　6、肺組織內EC-SOD mRNA表達量的變化
　　以GAPDH作為內對照，采用RT-PCR的方法測定大鼠肺組織內抗氧化酶 EC-SOD mRNA表達量的改變。HIRI組大鼠肺組織內的 EC-SOD mRNA水平（0.91±0.13）明顯高于Con組（0.49±0.08）（P<0.01）。此結果說明HIRI組大鼠肺組織內EC-SOD表達明顯升高。
　　7、大鼠肺組織內EC-SOD的蛋白表達水平

19、
　　大鼠肺組織內細胞外-超氧化物歧化酶（EC-SOD）的蛋白相對表達量，采用Western blotting方法測定。將其內參照GAPDH的比值作為其相對表達量，然后進行結果統(tǒng)計。數(shù)據表明：對照組大鼠肺組織中 EC-SOD的蛋白相對表達量（0.71±0.12）明顯低于肝缺血再灌注損傷組的相對表達量（1.09±0.18）（P<0.01），也表明大鼠肺組織內EC-SOD表達明顯增強。
　　結論：
　　1、大鼠肝臟缺血再灌