酵母雙雜交系統(tǒng)篩選豬流行性腹瀉病毒N蛋白互作宿主蛋白及N蛋白抗原表位鑒定.pdf

1、豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）感染豬小腸細(xì)胞致使細(xì)胞死亡脫落從而引起的急性傳染病，主要臨床癥狀是水樣腹瀉、嘔吐，對(duì)7日齡以內(nèi)哺乳仔豬尤為易感。自2010年以來(lái)，以變異PEDV為主要病原體的PED在我國(guó)爆發(fā)，并迅速席卷全國(guó)及周邊亞洲國(guó)家，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PEDV為典型的單股正鏈RNA冠狀病

2、毒，與其他冠狀病毒一樣具有四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白分別為纖突（Spike，S）蛋白、膜（Membrane，M）蛋白、小膜蛋白（Envelope，E）和核衣殼（Nucleocapsid，N），其中N蛋白是一個(gè)重要的結(jié)構(gòu)蛋白，并且高度保守，因此篩選PEDVN蛋白與宿主細(xì)胞的互作蛋白，以及篩選針對(duì)N蛋白抗原表位，對(duì)于探尋PEDV的致病機(jī)制和特異性新型疫苗研究等提供幫助。本實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　（1）為了獲得與PEDV N蛋白相互作用的宿主蛋

3、白。本研究構(gòu)建豬流行性腹瀉病毒N蛋白基因的重組載體pGBKT7-N，以其作為誘餌質(zhì)粒，采用酵母雙雜交方法，經(jīng)過(guò)兩次缺失培養(yǎng)基篩選，從豬肺泡巨噬細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選出與N蛋白相互作用的10個(gè)陽(yáng)性克??；將陽(yáng)性克隆的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中序列比對(duì)，結(jié)果顯示對(duì)應(yīng)著6種蛋白，分別為FTH1、LGALS3、CORO1C、SNRPG、KRTAP5-3和ZNF598，其中LGALS3和SNRPG兩種蛋白可能與病毒增殖及凋亡有關(guān)，具有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值，因

4、此對(duì)這兩種蛋白進(jìn)行了回返、自激活和Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí) LGALS3和SNRPG蛋白確實(shí)與N蛋白存在特異的相互作用且排除了假陽(yáng)性的可能。本研究為進(jìn)一步研究豬流行性腹瀉病毒 N蛋白的功能及病毒的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　（2）為了篩選和鑒定N蛋白的抗原表位核心區(qū)域，本實(shí)驗(yàn)將N基因截短為4個(gè)相互重疊的DNA片段N1、N2、N3、N4，將其分別克隆到質(zhì)粒pCold I中，構(gòu)建出4個(gè)重組質(zhì)粒pCold I-N1、pCold I-N2、

5、pCold I-N3、pCold I-N4，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)，進(jìn)行分段融合蛋白原核表達(dá)；將表達(dá)的分段蛋白再經(jīng) Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示只有N1（1-126aa）、N2（107-230aa）與N蛋白單克隆抗體反應(yīng)，說(shuō)明N蛋白的抗原表位區(qū)域在N1-N2（1-230aa）區(qū)域。同樣的方法與策略，將N1-N2（1-230aa）區(qū)域截短為10個(gè)相互重疊的DNA片段A1、A2、A3、A4、A5、A6、B1、B2、B3、B4，將其分