MiR-138通過下調(diào)ISG15的表達(dá)增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用.pdf

1、目的：研究肝癌細(xì)胞系對TRAIL耐藥的機(jī)制，探究 ISG15及miR-138在TRAIL耐藥機(jī)制中的作用，進(jìn)一步提高TRAIL對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
　　方法：首先選取四種肝癌細(xì)胞系LH86、SMMC-7721、HLC-Z01、Huh7細(xì)胞，以不同濃度TRAIL（1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml）處理四種的肝癌細(xì)胞系（4h、6h、8h、12h）， MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力，篩選出對TRAIL敏感的肝癌細(xì)胞系

2、及對TRAIL耐藥的肝癌細(xì)胞系。通過定量PCR及western blot實(shí)驗(yàn)檢測ISG15及miR-138在TRAIL敏感細(xì)胞及與TRAIL耐藥細(xì)胞中的表達(dá)差異。利用真核載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)在TRAIL敏感細(xì)胞中沉默ISG15且在TRAIL耐藥細(xì)胞中過表達(dá)ISG15，通過western blot實(shí)驗(yàn)分析其對TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。通過TargetScan預(yù)測分析，ISG15可能是miR-138的靶基因。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)在TRAI

3、L敏感細(xì)胞及耐藥細(xì)胞中過表達(dá)miR-138，通過定量PCR及western blot實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)miR-138對ISG15表達(dá)的影響，并通過western blot實(shí)驗(yàn)分析其對TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：1.TRAIL有肝癌細(xì)胞凋亡的作用，LH86、SMMC-7721細(xì)胞對TRAIL敏感，Huh7、HLC-Z01細(xì)胞對TRAIL耐藥。當(dāng)TRAIL濃度為10ng/ml，處理時(shí)間為8h時(shí)效果最佳。2.在TRAIL敏感細(xì)

4、胞中ISG15的表達(dá)水平較TRAIL耐藥細(xì)胞低，而TRAIL敏感細(xì)胞miR-138 的本底表達(dá)水平較耐藥細(xì)胞高。3.在敏感細(xì)胞中過表達(dá) ISG15能抑制TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，相反，在耐藥細(xì)胞中沉默ISG15能增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，提示ISG15在TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起調(diào)控作用，能抑制細(xì)胞凋亡。4.在敏感細(xì)胞及耐藥細(xì)胞中過表達(dá)miR-138能夠抑制ISG15的表達(dá)，表明ISG15為miR-138的靶

5、基因。5.在敏感細(xì)胞及耐藥細(xì)胞中過表達(dá)miR-138能夠增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。表明miR-138能調(diào)節(jié)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。6.當(dāng)同時(shí)過表達(dá)ISG15及miR-138時(shí)，TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果較本底水平降低。表明miR-138是通過調(diào)控ISG15的表達(dá)增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
　　結(jié)論：1.ISG15在TRAIL誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過程中起重要的調(diào)控作用。2.miR-138通過調(diào)節(jié)ISG15的表達(dá)增