2-DG通過下調RIP1增強TRAIL誘導乳腺癌細胞凋亡的敏感性.pdf

1、目的：⑴研究糖基化抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）對乳腺癌細胞增殖及凋亡的影響。⑵研究2-DG對腫瘤壞死因子誘導配體（tumors necrosis factor-related apotosis-inducing ligand，TRAIL）誘導腫瘤細胞凋亡的增強作用。⑶探討2-DG對內質網(wǎng)應激經典蛋白GRP78及凋亡抑制蛋白IAPs表達的影響。⑷探討2-DG對受體相互作用蛋白RIP1表達的影響

2、及下調RIP1后對TRAIL誘導的乳腺癌細胞凋亡的影響。
　　方法：①MTT法檢測不同濃度2-DG（1.25、2.5、5、10、20 mmol·L-1）及與TRAIL（200 ng·ml-1）合用處理人乳腺癌細胞MDA-MB-231及MDA-MB-43524、48、72 h后對細胞存活率的影響。②溴化丙啶（propidium iodide，PI）單染法檢測2-DG（10 mmol·L-1）與TRAIL（200 ng·ml-1）對人

3、乳腺癌細胞誘導凋亡的影響。③Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測2-DG（10 mmol·L-1）與TRAIL（200 ng·ml-1）對人乳腺癌細胞誘導凋亡的影響。④利用線粒體膜電位檢測（JC-1）試劑盒檢測2-DG（10 mmol·L-1）與TRAIL（200 ng·ml-1）對人乳腺癌細胞早期凋亡的影響。⑤Western blotting法檢測2-DG（10 mmol·L-1）與TRAIL（200 ng·ml-1

4、）處理人乳腺癌細胞MDA-MB-231和MDA-MB-435對凋亡關鍵蛋白Caspase-3、Caspase-8，凋亡抑制蛋白cIAP1、XIAP，受體相互作用蛋白RIP1以及原型抑制因子IkBα表達的影響。⑥利用siRNA下調RIP1后，PI單染法檢測對TRAIL(200 ng·ml-1)誘導乳腺癌細胞凋亡的影響。
　　結果：⑴MTT法結果顯示不同濃度2-DG（0、1.25、2.5、5、10、20 mmol·L-1）對人乳腺癌細

5、胞MDA-MB-231及MDA-MB-435有增殖抑制作用，且隨著2-DG濃度的增加和作用時間的延長，對人乳腺癌細胞 MDA-MB-231及MDA-MB-435增殖抑制作也不斷增強。10 mmol·L-12-DG作用于人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-435的24、48、72 h細胞存活率分別為84.96％、60.63%、53.39%和78.16%、53.94%、50.15%。當不同濃度2-DG與TRAIL（200 ng·

6、ml-1）聯(lián)合作用于細胞時，隨著2-DG濃度的增加和作用時間的延長，細胞的存活率與單用2-DG相比明顯降低。⑵10 mmol· L-12-DG、200 ng· ml-1 TRAIL以及合用組處理人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-43524 h，PI單染法檢測結果顯示：10 mmol· L-12-DG單用組誘導人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-435的24 h凋亡率分別為5.0%和3.8%，與陰性對照組相比比較

7、無統(tǒng)計學意義，200 ng· ml-1 TRAIL作用24 h誘導的人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-435的凋亡率分別為24.0%和22.3%，兩者合用后，凋亡率達到34.0%和36.1%。Annexin V-FITC/PI雙染法結果與單染法所得結果一致。⑶實驗中采用10 mmol·L-12-DG、200 ng·ml-1 TRAIL以及合用組處理人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-43524 h，JC-1檢測

8、結果顯示：單用組沒有觀察到紅色熒光向綠色熒光轉變，合用組紅色熒光向綠色熒光轉變較明顯。⑷Western blotting結果顯示：空白對照組、10 mmol·L-12-DG單用組中沒有Caspase-3、Caspase-8的激活， TRAIL單用組與對照組相比有一定的Caspase-3、Caspase-8得激活，二者合用后，Caspase-3、Caspase-8的激活明顯增加（圖6）。且隨著2-DG作用時間的延長，GRP78及TRAIL

9、-R2的表達逐漸增強（圖7），cIAP1、XIAP及RIP1的表達都逐漸減弱。⑸siRNA預處理人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-43524 h后，western boltting法檢測RIP1表達明顯降低。采用同樣方法，siRNA預處理細胞24 h后，采用10 mmol·L-12-DG、200 ng·ml-1 TRAIL處理細胞24 h，PI單染法檢測細胞凋亡，結果顯示：與陰性對照組相比， siRNA預處理后，合用組細胞

10、的凋亡率明顯增加。⑹Western boltting法檢測原型抑制因子IκBα的變化，結果顯示：采用10 mmol· L-12-DG處理人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-435，隨著2-DG作用時間的延長，原型抑制因子IkBα表達逐漸減弱。
　　結論：①2-DG對人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-435具有增殖抑制作用，且隨著濃度的增加和作用時間的延長，細胞存活率逐漸降低，但細胞對2-DG誘導的凋亡不敏