IL-37通過誘導Smad3磷酸化信號轉(zhuǎn)換抑制肝癌細胞增殖的機制研究.pdf

1、本文對IL-37通過誘導Smad3磷酸化信號轉(zhuǎn)換抑制肝癌細胞增殖的機制進行了研究。本研究分為三個部分：
　　第一部分：IL-37基因慢病毒表達載體的構建與鑒定。
　　目的：構建攜帶IL-37基因的重組慢病毒載體GV358-IL-37，為后續(xù)體內(nèi)外相關實驗奠定基礎。
　　方法：PCR擴增IL-37基因片段后，定向連接至已酶切線性化的慢病毒載體，獲得IL-37重組慢病毒GV358-IL-37并轉(zhuǎn)換細菌感受態(tài)細胞；對陽性克隆

2、菌落行PCR鑒定；對重組質(zhì)粒測序并轉(zhuǎn)染入293T細胞，倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達，Western-blot檢測目的基因表達；最后將重組質(zhì)粒與慢病毒包裝系統(tǒng)一同轉(zhuǎn)染293T細胞進行病毒包裝，藥篩法檢測病毒滴度。
　　結(jié)果：將目的基因片段行PCR擴增后連接至線性化表達載體，陽性轉(zhuǎn)換子PCR產(chǎn)物大?。?49 bp，陰性轉(zhuǎn)換子PCR產(chǎn)物大?。?85 bp，測序結(jié)果示：陽性克隆與目的基因序列完全一致；將GV358-IL-37重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

3、293T細胞后，細胞內(nèi)可觀察到明顯的綠色熒光，經(jīng)Western Blot檢測可觀察到30 kDa附近有特征條帶，大小與目的基因相吻合；包裝慢病毒48小時后提取并濃縮慢病毒，藥篩法測得病毒滴度為9E+5 TU/ml。
　　結(jié)論：將IL-37基因與酶切后的慢病毒載體GV358進行定向連接，成功構建出含有IL-37基因編碼序列的重組慢病毒載體GV358-IL-37；將其轉(zhuǎn)染入293T細胞，行Western Blot檢測目的蛋白表達，結(jié)果

4、顯示目的基因IL-37可成功表達；最后通過慢病毒包裝系統(tǒng)，成功獲得滴度為9E+5 TU/ml的重組慢病毒，為后續(xù)體內(nèi)外相關實驗奠定基礎。
　　第二部分：IL-37在肝癌中的表達及其對肝癌細胞增殖的影響并初步探討其分子機制。
　　目的：觀察IL-37在人HCC細胞中的表達水平與HCC臨床病理特征、預后的相關性，分析調(diào)控IL-37的表達對HCC細胞增殖的影響，并初步探討其潛在的分子機制。
　　方法：收集101例HCC新鮮組

5、織標本，經(jīng)Real-time qPCR和IHC檢測癌組織及其對應癌旁組織中IL-37的表達水平，并用Spearman秩相關分析、Kaplan-Meier生存曲線、COX回歸分析IL-37表達與HCC臨床病理特征、預后的相關性；Real-time qPCR和Western-blot檢測正常肝細胞系LO2，QSG-7701與HCC細胞系SMMC-7721，HepG2，Huh7， MHCC-97H的IL-37表達水平的差異；在HCC細胞中過表

6、達IL-37和SiRNA沉默IL-37的表達，CCK-8和克隆形成實驗觀察IL-37對HCC細胞增殖的影響；用Annexin V-FITC和PI雙染法檢測細胞凋亡，PI染色檢測細胞周期，經(jīng)流式細胞儀分析結(jié)果；Western-blot檢測c-myc，p21， cyclinB1，cdc2，cyclinA2，cyclinD1的表達。
　　結(jié)果：在101對HCC組織中有85對（85.15％) IL-37的表達水平低于對應癌旁組織；IHC分

7、析101例HCC組織IL-37表達水平，根據(jù)染色結(jié)果分為高表達組（n=50)和低表達組（n=51)；Spearman秩相關分析示：IL-37的表達水平與腫瘤大小(P=0.046)、BCLC分期(P=0.030)、微血管侵襲(P=0.046)相關；Kaplan-Meier生存曲線示：高表達IL-37的HCC患者總生存期和無病生存期均高于低表達IL-37的HCC患者（中位總生存期46.0個月VS25.0個月，P=0.011；中位無病生存期2

8、9.0個月 VS17.0個月, P=0.007）；單因素COX回歸分析示：影響HCC總生存期的危險因素是組織學分級(P=0.009)， BCLC分期(P=0.033)，微血管侵襲(P=0.030)和IL-37表達水平(P=0.013)；影響HCC無病生存期的危險因素是腫瘤大小(P=0.023)，組織學分級(P=0.005)，BCLC分期(P=0.017)，微血管侵襲(P=0.009)和IL-37表達水平(P=0.009)；多因素COX回

9、歸分析示：影響HCC總生存期的獨立危險因素是組織學分級(P=0.017)和IL-37表達水平(P=0.050)；影響HCC無病生存期的獨立危險因素是組織學分級(P=0.010)、微血管侵襲(P=0.046)和IL-37表達水平(P=0.045)；qRT-PCR、Western-blot結(jié)果示：HCC細胞系中IL-37的表達水平顯著低于正常肝細胞；CCK-8和克隆形成實驗顯示：與對照組（LV_NC）相比LV_IL1F7組可顯著抑制人HCC

10、細胞系HepG2、SMMC7721的增殖（P＜0.05）；與對照組（Si_NC）相比Si_IL1F7可顯著促進人HCC細胞系HepG2、SMMC7721的增殖（P＜0.05）；細胞凋亡實驗結(jié)果顯示：過表達或者沉默IL-37的表達不能影響HepG2、SMMC7721細胞的凋亡（P＞0.05）；細胞周期實驗結(jié)果顯示：LV_IL1F7可誘導HepG2、SMMC7721細胞G2/M期阻滯，Si_IL1F7則降低HepG2、SMMC7721細胞G

11、2/M期阻滯（P＜0.05）；Western-blot結(jié)果顯示：與對照組相比， LV_IL1F7可顯著抑制HepG2、SMMC7721細胞c-myc，cdc2，cyclinB1的表達，同時上調(diào)p21的表達（P＜0.05）；與對照組相比，Si_IL1F7可顯著促進HepG2、SMMC7721細胞c-myc，cdc2，cyclinB1的表達，同時下調(diào)p21的表達（P=0.05）。
　　結(jié)論：HCC中低表達IL-37與HCC的臨床病理特

12、征及預后密切相關，并通過誘導HCC細胞阻滯于G2/M期抑制HCC細胞增殖，其機制與促進腫瘤細胞上調(diào)c-myc，cdc2，cyclinB1，下調(diào)p21的表達有關。
　　第三部分：IL-37通過TGF-β/Smad3的磷酸化信號轉(zhuǎn)換抑制HCC細胞增殖的作用及分子機制研究。
　　目的：深入探討和分析TGF-β/Smad3信號通路在IL-37抑制HCC細胞增殖的作用及分子機制，并在體內(nèi)實驗中驗證體外實驗結(jié)果。
　　方法:Wes

13、tern-blot分析過表達IL-37與沉默 IL-37后， Smad3、pSmad3C、pSmad3L的表達；用含有TGF-β的培養(yǎng)基培養(yǎng)pSmad3C磷酸化抑制劑SIS3預處理的 SMMC-7721細胞，觀察過表達IL-37對pSmad3C、pSmad3L、c-myc、p21的表達影響；用含有TNF-α的培養(yǎng)基培養(yǎng)JNK磷酸化抑制劑SP600125預處理的SMMC-7721細胞，觀察過表達IL-37對pSmad3C、pSmad3L、

14、c-myc、p21的表達影響，并用ELISA法檢測細胞上清中TGF-β，IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α和MMP2的表達；CCK-8實驗檢測經(jīng) TGF-β預處理的 LV_IL1F7-SMMC-7721細胞及LV_NC-SMMC-7721細胞的增殖情況；構建裸鼠皮下成瘤動物模型，在體內(nèi)觀察LV_IL1F7-SMMC-7721組與LV_NC-SMMC-7721組裸鼠腫瘤增殖的差異；Western-blot檢測皮下種植瘤pSmad3

15、C、pSmad3L、p21、c-myc、cdc2、cyclinB1的表達水平；ELISA法檢測裸鼠血清中TGF-β，IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α和MMP2的表達；IHC檢測101例HCC及其癌旁組織中pSmad3L的表達，并分析其與IL-37表達的相關性；Kaplan-Meier生存曲線分析pSmad3L表達與HCC臨床病理特征及預后的相關性。
　　結(jié)果：與對照組相比，過表達IL-37，對Smad3表達無影響，但可顯

16、著抑制pSmad3L的表達水平，上調(diào)pSmad3L的表達，沉默IL-37則可促進 pSmad3L的表達水平，抑制 pSmad3C的表達；TNF-α處理SMMC-7721LV_NC細胞可激活pSmad3L/c-myc信號，抑制pSmad3C/p21信號，但SMMC-7721LV_IL1F7細胞中pSmad3L/c-myc信號表達受到抑制，而pSmad3C/p21信號表達顯著增強；過表達IL-37對JNK以及pJNK的表達無影響；與對照組相

17、比， JNK抑制劑 SP600125預處理SMMC-7721LV_NC和SMMC-7721LV_IL1F7細胞后，再加TNF-α處理細胞， pSmad3L/c-myc信號表達受到抑制，而pSmad3C/p21信號表達顯著增強；TGF-β處理SMMC-7721LV_NC和SMMC-7721LV_IL1F7細胞，pSmad3C/p21信號表達均顯著增強，但SMMC-7721LV_IL1F7與對照組SMMC-7721LV_NC相比，pSmad

18、3L/c-myc信號表達仍受到抑制；用TGF-β1依賴的Smad3磷酸化特異性抑制劑SIS預處理SMMC-7721LV_NC和SMMC-7721LV_IL1F7細胞，再用TGF-β處理各組細胞，SMMC-7721LV_IL1F7組pSmad3L/c-myc信號表達受到抑制，但SMMC-7721LV_NC組pSmad3C/p21信號表達無變化， ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清結(jié)果示：SMMC-7721LV_ IL1F7組與SMMC-7721L

19、V_NC組相比，TGF-β表達水平明顯升高，IL-6, IL-8, IL-1β, TNF-α和MMP2表達水平顯著下降；CCK-8實驗示：SIS預處理，可減弱 IL-37對腫瘤增殖的抑制作用；裸鼠成瘤實驗結(jié)果證實：SMMC-7721LV_IL1F7組，皮下種植瘤的體積（P=0.02），重量（P=0.004）顯著小于對照組；WB結(jié)果示：SMMC-7721LV_IL1F7組pSmad3L/c-myc, Cyclin B1, cdc2的表達顯

20、著下調(diào)，pSmad3C/p21的表達顯著上調(diào)；ELISA結(jié)果示：SMMC-7721LV_IL1F7組與對照組相比，TGF-β表達水平明顯升高IL-6, IL-8, IL-1β, TNF-α和MMP2表達水平顯著下降；IHC結(jié)果示：IL-37與pSmad3L的表達呈負相關（r=-0.3315,P=0.0007）, Kaplan-Meier生存分析結(jié)果示：高表達pSmad3L的患者OS， DFS時間均低于低表達pSmad3L的患者。