靶向干預(yù)NF-κB及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對ApoE---小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的：⑴通過重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的IκBα過表達(dá)抑制NF-κB信號通路的激活，研究對ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化（AS）斑塊的作用和對 NF-κB下游因子表達(dá)的影響；⑵通過藥物尼可地爾干預(yù)動(dòng)脈粥樣中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中凋亡相關(guān)蛋白和NF-κB信號通路，研究其對動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的調(diào)控作用。
　　方法：①8周齡ApoE-/-小鼠分別給予高脂飲食和普通飲食8，12，16，20，24周后，檢測血脂表達(dá)情況，油紅O染色觀察斑塊面積。通過尾靜脈注射

2、 AAV9-CMV-eGFP，5.0×1011vg/只/100μl，轉(zhuǎn)染 ApoE-/-小鼠。WB及激光共聚焦方法檢測綠色熒光蛋白在粥樣斑塊內(nèi)的表達(dá)情況。觀察腺相關(guān)病毒對ApoE-/-小鼠肝功、腎功、心肌酶的影響。通過AAV9轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞、肝臟細(xì)胞后使用TUNEL方法檢測細(xì)胞凋亡情況；②重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的IκBα過表達(dá)對ApoE-/-小鼠AS的抑制作用：將8周齡雄性ApoE-/-小鼠分為空白對照組、AAV9-GFP空載病毒組和AAV9

3、-IκBα病毒干預(yù)組，每組25只。生理鹽水對照組小鼠尾靜脈注射生理鹽水，剩余兩組小鼠分別給予注射AAV9-CMV-GFP空病毒或腺相關(guān)病毒IκBα載體（AAV9-CMV-IκBα）。干預(yù)后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)5周后，麻醉處死。檢測血脂指標(biāo)；油紅O染色法檢測動(dòng)脈血管的脂質(zhì)斑塊面積；HE染色法檢測小鼠主動(dòng)脈血管粥樣斑塊的面積；天狼猩紅染色法檢測斑塊的膠原含量；免疫組化檢測斑塊巨噬細(xì)胞（MOMA-2）和平滑肌細(xì)胞（SMC），炎癥因子比例；實(shí)時(shí)熒光定量

4、法測定炎癥因子的mRNA表達(dá)；免疫印跡法及免疫熒光檢測主動(dòng)脈血管NF-κB通路相關(guān)蛋白；③藥物尼可地爾抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和NF-κB通路，對ApoE-/-小鼠AS的抑制作用，實(shí)驗(yàn)分三組：生理鹽水對照組，尼可地爾組，阿托伐他汀組，每組各25只小鼠。三組ApoE-/-小鼠喂養(yǎng)16周后，分別給予生理鹽水，尼可地爾和阿托伐他汀灌胃治療，藥物灌胃連續(xù)治療8周后，將小鼠麻醉處死。檢測血脂指標(biāo)。油紅O染色法檢測脂質(zhì)斑塊面積；HE染色法檢測斑塊的面積；天狼

5、猩紅染色法檢測斑塊的膠原含量；免疫組化法檢測斑塊內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78和CHOP，以及巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、炎癥因子的比例；實(shí)時(shí)熒光定量法測定小鼠主動(dòng)脈組織炎癥因子的mRNA表達(dá)；免疫印跡法檢測主動(dòng)脈血管內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡相關(guān)蛋白JNK、P-JNK、Caspase-12等及NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。TUNEL方法檢測斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：⑴血脂檢測結(jié)果顯示高脂飲食組總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白

6、（LDL-C）水平顯著高于普通飲食組（P＜0.05），油紅 O染色結(jié)果顯示高脂飲食組形成斑塊病變比普通飲食組更快（P＜0.05），ApoE-/-小鼠高脂飲食喂養(yǎng)16周時(shí)可形成穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣模型。AAV9-eGFP病毒轉(zhuǎn)染AS小鼠后，其主動(dòng)脈血管激光共聚焦和Western blot結(jié)果顯示rAAV9-eGFP可有效轉(zhuǎn)染小鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊并持續(xù)表達(dá)，病毒轉(zhuǎn)染在第35天達(dá)高峰。轉(zhuǎn)染病毒后的ApoE-/-小鼠血清中心肌酶、肝功、腎功較對照組小鼠

7、無顯著變化（P＞0.05），AAV9-GFP病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞，未對兩者的凋亡產(chǎn)生影響（P＞0.05）。⑵與對照組和空載病毒組相比，IκBα干預(yù)組小鼠的動(dòng)脈脂質(zhì)斑塊面積和粥樣斑塊面積無明顯減少（P＞0.05）。但I(xiàn)κBα小鼠組較生理鹽水對照組和空載病毒組顯著改善了粥樣斑塊的穩(wěn)定性：生理鹽水對照組、AAV9-GFP空載病毒組和AAV9-IκBα三組，天狼猩紅染色檢測斑塊內(nèi)膠原成分百分比分別為9.50±2.21；9.31±2.62；1

8、6.43±1.83；AAV9-IκBα較其他兩組膠原含量顯著增加（P＜0.01），巨噬細(xì)胞含量的百分比分別為27.91±3.32；28.5±3.21；17.84±3.35；平滑肌細(xì)胞含量的百分比分別為9.32±2.36；9.90±2.42；16.83±2.21；AAV9-IκBα組較對照組和空病毒載體組巨噬胞含量顯著減少，而顯著增加了斑塊內(nèi)的平滑肌的含量（P＜0.01）。三組小鼠斑塊易損指數(shù)分別為1.24±0.20；1.25±0.18；

9、0.54±0.14；AAV9-IκBα組較生理鹽水對照組和AAV9-GFP空病毒組易損指數(shù)顯著降低，改善了斑塊的穩(wěn)定性（P＜0.01）。IκBα干預(yù)組無論是蛋白水平還是mRNA基因水平較生理鹽水對照組和空載病毒組均可顯著下調(diào)斑塊內(nèi)炎癥因子 IL-6（P＜0.05）、TNF-α（P＜0.05）、趨化因子MCP-1（P＜0.05）及金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2（P＜0.05）的表達(dá)。IκBα基因過表達(dá)可以阻遏NF-κB通路的激活，抑制P-P65

10、蛋白表達(dá)（P＜0.05）；AAV9-IκBα轉(zhuǎn)染后，斑塊內(nèi)蛋白P65免疫熒光核轉(zhuǎn)位水平較生理鹽水對照組和AAV9-GFP空載病毒組明顯下調(diào)（P＜0.05）。⑶尼可地爾組和阿托伐他汀組與生理鹽水組比較，均可抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展。三組小鼠間體重、血壓、血脂無明顯差異（P＞0.05）。RT-PCR檢測三組小鼠的主動(dòng)脈 mRNA，尼可地爾組和阿托伐他汀組較生理鹽水組可顯著降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和CHOP mRNA的表達(dá)（P＜0.

11、05）；IHC結(jié)果示：GRP78蛋白在生理鹽水對照組小鼠、尼可地爾組小鼠、阿托伐他汀組小鼠斑塊內(nèi)的百分率分別為22.31±3.32；15.33±3.21；10.64±2.35（P＜0.01）；CHOP蛋白的百分率分別為12.40±2.57；8.80±2.16；4.90±2.20（P＜0.01）。油紅O大體染色脂質(zhì)斑塊在三組小鼠間大體血管內(nèi)皮的沉積分別為50.4±4.63、43.4±3.41、37.7±3.12（％），尼可地爾組或阿托伐他

12、汀組與生理鹽水組比較均可顯著降低脂質(zhì)斑塊沉積（P＜0.05）；三組小鼠斑塊易損指數(shù)分別為1.44±0.20；0.77±0.14；0.52±0.15；尼可地爾組或阿托伐他汀組與生理鹽水對照組比較可顯著降低斑塊易損指數(shù)（P＜0.05）。尼可地爾組或阿托伐他汀組可從蛋白及基因水平降低斑塊內(nèi)的炎癥因子的表達(dá)（P＜0.05）。尼可地爾組和阿托伐他汀組均可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP、P-JNK、Caspase-12的表達(dá)，上調(diào)凋亡相

13、關(guān)蛋白Bcl-2/Bax（P＜0.05）；TUNEL檢測兩組均可抑制斑塊內(nèi)的細(xì)胞凋亡（P＜0.05）；還可以顯著上調(diào)IκBα（P＜0.05），抑制P-P65蛋白表達(dá)（P＜0.05），阻遏NF-κB通路的激活。
　　結(jié)論：①AAV9-CMV-GFP病毒尾靜脈注射轉(zhuǎn)染 AS模型 ApoE-/-小鼠，可以持續(xù)在粥樣硬化斑塊中表達(dá)，轉(zhuǎn)染高峰在35天左右，血清學(xué)檢測未發(fā)現(xiàn)明顯的心臟、肝臟和腎臟毒性，具有一定的安全性，可作為基因治療動(dòng)脈粥樣硬

14、化的良好載體；②通過AA9病毒作為載體，使IκBα基因在形成AS的ApoE-/-小鼠過表達(dá)后，靶向抑制小鼠主動(dòng)脈斑塊NF-κB信號通路的激活，穩(wěn)定斑塊，下調(diào)NF-κB信號通路下游的炎性靶基因的表達(dá)，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展；③動(dòng)脈粥樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和NF-κB是過度激活的，尼可地爾通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡和上調(diào)NF-κB中IκBα表達(dá)水平，抑制NF-κB信號通路的激活，抑制斑塊炎癥反應(yīng)，減少小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，穩(wěn)定斑塊，從而達(dá)到抑制動(dòng)