達格列凈對糖尿病ApoE---小鼠動脈粥樣硬化的作用及其機制研究.pdf

1、隨著人們生活水平的不斷提高，全世界的2型糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)患病率迅速增多，尤其在發(fā)展中國家更為明顯。與非糖尿病相比，糖尿病患者的心血管疾?。ㄈ鐒用}粥樣硬化性疾病、心肌病等）患病率明顯增高、病情進展較快以及多臟器同時受累[1]。其中動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)為糖尿病患者主要血管并發(fā)癥，其具體機制目前尚不十分清楚，大多數(shù)專家認為其是一種慢性炎癥反應[2-4]。動脈粥樣硬化將使心肌梗死

2、(Myocardial Infarction，MI)和急性腦卒中的發(fā)生幾率明顯提高[5]。動脈粥樣硬化病變在最早期是由于動脈內膜對炎性細胞如單核巨噬細胞的募集，血液循環(huán)中的白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素18（interleukin-18，IL-18）等促炎因子的水平與心血管危險性呈正相關。而斑塊中的單核巨噬細胞是最重要的炎性細胞，

3、它是先天性免疫系統(tǒng)的原型細胞，存在于動脈粥樣硬化病變的各個時期，其釋放的促炎因子有很關鍵的作用，其中IL-1β和IL-18是最重要的加速動脈粥樣硬化發(fā)展的促炎癥因子[6]。巨噬細胞是體內IL-1β和IL-18產生的主要炎性細胞，其聚集在血管病變部位是啟動局部炎癥反應和斑塊形成的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)代謝產物能夠被巨噬細胞質中核苷酸結合和寡聚結構域樣受體(nucleotide-binding and oligomerization domai

4、n-like receptors，NLR)感知，NLR與細胞漿內斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）及半胱天冬酶-1（caspase-1，Casp-1）形成復合物促進炎癥細胞因子的成熟，故稱為炎癥小體[7.8]。其中NLRP3是與慢性炎癥反應關系最密切的炎癥小體，能感知體內無菌性代謝產物的刺激而活化[9]。NLRP3炎癥小體是目前人們熱衷于研究的一種先天免疫胞內模式識別受體

5、，在固有免疫中起了決定性的作用[10]。當配體與NLRP3結合后促進炎癥小體的形成，并活化Casp-1，最終促進前白介素1β(pro-interleukin-1β，pro-IL-1β)和前白介素18（pro-interleukin-18，pro-IL-18）的成熟及分泌[11]，產生促炎因子IL-1β和IL-18。大量研究證實IL-1β和IL-18與動脈粥樣硬化的炎癥反應密切相關，其在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要的角色[12,13

6、]。
　　鈉-葡萄糖共轉運蛋白2(sodium glucose co-transporters2，SGLT-2)抑制劑，主要通過抑制腎臟重吸收葡萄糖而達到降糖的效果。研究發(fā)現(xiàn)，SGLT-2抑制劑能夠降低血清和器官（如肝臟和腎臟）中的如白介素6（interleukin-6，IL-6）、單核細胞趨化因子1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）和TNF-α等炎癥標志物，從而降低糖尿病動物模型

7、的血管動脈硬化度[14，15]。此外，Terami等人給予達格列凈治療糖尿病小鼠（diabetes mouse，db/db小鼠），發(fā)現(xiàn)治療組巨噬細胞浸潤、炎癥基因如骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、MCP-1和轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)的表達均下降。研究還發(fā)現(xiàn)達格列凈治療抑制了db/db小鼠腎臟的氧化應激和細胞凋亡，延緩糖尿病腎臟的發(fā)生、發(fā)展[16]。因此，我們設想達

8、格列凈對糖尿病動脈粥樣硬化的形成有抑制作用，并可能與NLRP3炎癥小體活化減少相關。
　　為驗證該假設，我們用佐鏈菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射載脂蛋白(ApoE)基因敲除(ApoE-/-)小鼠形成糖尿病小鼠，給予高脂飼料喂養(yǎng)，構建糖尿病動脈粥樣硬化動物模型，同時用達格列凈或者對照劑進行干預，在體及離體觀察糖脂代謝對炎癥小體活化、動脈粥樣硬化形成及NLRP3信號通路開放，從整體-細胞水平證明我們的假說。

9、>　　目的：
　　觀察達格列凈對STZ誘導的糖尿病ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的影響及其可能的機制。
　　方法：
　　高脂喂養(yǎng)STZ誘導的DM ApoE-/-小鼠建立實驗性糖尿病動脈粥樣硬化小鼠模型;C57BL/6J小鼠為正常組，給予普通飼料。ApoE-/-小鼠給予達格列凈1mg/kg.d或者對照劑灌胃治療12周后，眼眶取血測血清甘油三酯(triglycerides，TG)、總膽固醇(total cholestero

10、，TCH)、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平;取主動脈行油紅O染色(oil red O)分析斑塊面積及脂質沉積數(shù)量，蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin，HE)觀察病理形態(tài)變化，酶聯(lián)免疫

11、吸附劑測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測量血清NLRP3，IL-1β和IL-18，免疫熒光(immunofluorescence，IF)檢測斑塊內巨噬細胞浸潤情況和斑塊穩(wěn)定性;蛋白質印跡(western blot，WB)分析主動脈中的NLRP3炎癥小體和促炎因子IL-1β，IL-18的表達情況。同時用二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)測定動脈粥樣硬化斑塊中活性氧物質(

12、reactive oxygen species，ROS)的含量。除此之外，培養(yǎng)野生型(wild type，WT)C57小鼠和NLRP3基因敲出小鼠（NLRP3-/-小鼠）原代巨噬細胞，給予脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)刺激NLRP3炎癥小體的激活，同時給予高糖（high glucose，HG）、棕櫚酸(palmitic acid，PA)刺激，用

13、達格列凈或者對照劑干預細胞，觀察炎癥因子IL-1β的變化。
　　結果：
　　達格列凈降低了DM小鼠的血糖(p＜0.01)及非糖尿病(non-diabetes mellitus，NDM)ApoE-/-小鼠的血糖(p＜0.05);達格列凈還減少了DM小鼠的FFA和TG(P＜0.05)水平。HE染色及油紅O結果顯示，達格列凈抑制了DM小鼠動脈粥樣硬化的形成(P＜0.01)，同時減少了斑塊內脂質沉積，對NDM小鼠影響不大。此外，達格

14、列凈降低了DM小鼠血清NLRP3(P＜0.01)，IL-1β(P＜0.05)和IL-18(P＜0.05)的濃度，而在NDM ApoE-/-小鼠中，達格列凈僅減少了IL-1β濃度(P＜0.05);主動脈冰凍切片行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)達格列凈抑制了DM小鼠斑塊中巨噬細胞的浸潤并降低了平滑肌細胞的減少，增加了斑塊的穩(wěn)定性;此外，主動脈冰凍切片行DHE染色，發(fā)現(xiàn)達格列凈抑制了DM小鼠ROS的產生;Western blot表明達格列凈抑制了DM小鼠

15、主動脈中NLRP3炎癥小體的表達，減少了IL-1β、IL-18的生成和釋放，提示該作用可能與ROS的產生減少有關。細胞實驗結果顯示，飽和脂肪酸(PA)和高糖(HG)聯(lián)合刺激能激活巨噬細胞中NLRP3炎癥小體，產生促炎因子IL-1β，而達格列凈干預后并沒有抑制NLRP3炎癥小體的激活，表明達格列凈不能直接作用于巨噬細胞影響NLRP3炎癥小體的激活。此外，用PA和HG刺激NLRP3-/-和WT小鼠的原代巨噬細胞，我們發(fā)現(xiàn)，與WT巨噬細胞相比