補(bǔ)血草鹽腺細(xì)胞特異性cDNA文庫(kù)構(gòu)建.pdf

1、土壤中過(guò)多的可溶性鹽分對(duì)植物的不利影響是多種多樣的，全世界約有20％的土地鹽漬化，還有近50％的灌溉土地受次生鹽漬化的影響。鹽漬化對(duì)可耕地的破壞影響和制約著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。因而，研究植物的耐鹽機(jī)理顯得尤為重要。根據(jù)鹽生植物的抗鹽生理機(jī)制及其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生態(tài)學(xué)特征的不同，Breckle(1990)將鹽生植物概括為三類：真鹽生植物、假鹽生植物和泌鹽鹽生植物。 泌鹽鹽生植物種類繁多，在我國(guó)分布也極其廣泛，海濱、鹽沼、鹽湖周邊、沙漠、草甸

2、和灌叢等地都有泌鹽鹽生植物分布。植物泌鹽是一個(gè)主動(dòng)的生理過(guò)程，泌鹽鹽生植物主要通過(guò)葉片或莖上的鹽腺(salt gland)或鹽囊泡(salt bladder)將過(guò)多的鹽分排出體外，以此逃避鹽脅迫。中華補(bǔ)血草(Limonium sinense Kuntze)為白花丹科補(bǔ)血草屬(Limonium)多年生泌鹽草本植物，它具有特殊的泌鹽結(jié)構(gòu)-鹽腺，可將吸收到體內(nèi)的鹽離子排到體外，從而避免鹽分脅迫的傷害。 本研究主要利用顯微切割技術(shù)(La

3、ser Microdissection，LMD)，從撕取的中華補(bǔ)血草的下表皮上切取鹽腺細(xì)胞，從中提取出鹽腺細(xì)胞中的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄體外擴(kuò)增出aRNA，以用于構(gòu)建補(bǔ)血草鹽腺細(xì)胞特異性cDNA文庫(kù)。在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：(1)用Carnoy's固定液固定材料，既能脫色又能很好地保存RNA，甚至從固定3個(gè)月的樣品中仍能提取出較多的RNA。(2)五月至十月，中華補(bǔ)血草的葉片變得肉質(zhì)化，變脆，難以撕取下表皮，取材具有階段性。(3)用含異硫氰酸胍的裂

4、解液裂解補(bǔ)血草下表皮細(xì)胞，從中提取的總RNA量很少，甚至于電泳檢測(cè)不到條帶，而用改良的CTAB法提取效果較好。(4)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，從300mMNaCl處理的材料中提取出的RNA在量上要比非鹽處理材料的多，盡管不能確定所得到RNA的量的差異是否是因?yàn)辂}處理造成的，但是在取材前用300mMNaCl處理補(bǔ)血草植株應(yīng)該是有利無(wú)害。由于時(shí)間和材料的限制，本研究?jī)H對(duì)補(bǔ)血草鹽腺細(xì)胞特異性cDNA文庫(kù)的構(gòu)建進(jìn)行了初步的探討，沒(méi)有完成最后的cDNA文庫(kù)的構(gòu)

5、建工作。 其次，本研究通過(guò)掃描電鏡技術(shù)（Scanning Electron Microscopes，SEM）研究了中華補(bǔ)血草鹽腺的發(fā)育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)經(jīng)過(guò)鹽處理的中華補(bǔ)血草葉中鹽腺的數(shù)目比未經(jīng)鹽處理的多，但是在發(fā)育開(kāi)始的時(shí)間上沒(méi)有明顯差別。(2)在同一片幼葉中可同時(shí)存在發(fā)育成熟的和發(fā)育中的鹽腺細(xì)胞，即同一片葉上可存在不同發(fā)育階段的鹽腺細(xì)胞。(3)中華補(bǔ)血草鹽腺細(xì)胞的發(fā)育時(shí)間要遠(yuǎn)比氣孔的發(fā)育時(shí)間早。 另外，本實(shí)驗(yàn)還結(jié)合一

6、種新的Na+特異性的指示劑Coro NaGreen研究了哇巴因（ouabain，一種動(dòng)物Na+/K+-ATPase的抑制劑）對(duì)中華補(bǔ)血草的生長(zhǎng)情況及其根尖中鈉的含量和分布的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鹽(200mMNaCl)和抑制劑(100μM ouabain)共同處理?xiàng)l件下，根尖中鈉特異性的熒光明顯增強(qiáng)，顯示Na+含量顯著升高。因而得出結(jié)論：在哇巴因處理下，植物體內(nèi)發(fā)生Na+的積聚，從而推測(cè)補(bǔ)血草中存在某種對(duì)ouabain敏感的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)體，且它對(duì)