幾種皮膚特異性表達載體的構建及轉基因細胞鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、羊絨的生長十分復雜，受到環(huán)境和遺傳因素的共同影響，與毛囊的分化、形成、毛囊周期密切相關，這一過程受到一些抑制絨毛生長基因如FGF5，FGF18等的調控，同時也受到一些促絨毛生長基因如EGF，VEGF等的調控。在絨山羊育種領域，通過轉基因技術將外源促絨毛生長基因轉入絨山羊體內或者敲除抑制絨毛生長的特定基因，成為提高絨毛產量研究的熱點。
　　本研究包括兩部分的內容，一是構建皮膚特異性表達Cre重組酶基因載體，以應用于將來條件性敲除抑制

2、絨毛生長的基因;二是構建含有多克隆位點的皮膚特異性表達功能基因的通用載體，為下一步構建皮膚特異性表達促絨毛生長基因的載體提供條件。實驗首先采用PCR技術克隆皮膚特異性表達的人表皮角蛋白5啟動子(Hum keratin5 promoter，K5)和角蛋白14啟動子(Hum keratin14promoter, K14)及Cre重組酶基因，之后以pIRES2-EGFP-KAP6載體為基本骨架，通過重組連接，構建了pIRES2-EGFP-KA

3、P6-Cre、pIRES2-EGFP-K5和pIRES2-EGFP-K14等3種皮膚特異性表達的載體;同時構建了含CMV啟動子的pIRES2-EGFP-Cre非特異性表達載體;將pIRES2-EGFP-KAP6-Cre和pIRES2-EGFP-Cre兩種載體以LipofectamineTM2000介導，分別穩(wěn)定轉染內蒙古白絨山羊胎兒成纖維細胞和皮膚成纖維細胞，篩選轉基因細胞系并應用RT-PCR方法檢測外源基因的表達。
　　結果表明

4、，pIRES2-EGFP-KAP6-Cre、pIRES2-EGFP-K5和pIRES2-EGFP-K14等皮膚特異性表達載體和含CMV啟動子的pIRES2-EGFP-Cre非特異性載體構建成功，載體測序正確，各元件按正確的順序連接。pIRES2-EGFP-KAP6-Cre，pIRES2-EGFP-Cre載體轉染內蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞和胎兒成纖維細胞，PCR結果顯示外源基因整合到了細胞基因組中。半定量RT-PCR檢測pIRES2-E

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