肝星狀細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、【目的】：
　　構(gòu)建含有靶向活化肝星狀細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的質(zhì)粒,并于體外檢測(cè)其表達(dá)情況。
　　【方法】：
　?、倮镁酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)從PMIR-luciferase質(zhì)粒中擴(kuò)增得到目的基因——表達(dá)螢火蟲熒光素酶基因片段即luciferease基因以及MCS多克隆位點(diǎn)+PloyA尾巴片段,通過雙酶切將其連接克隆至含有α平滑肌肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(αSMA啟動(dòng)子)的Psmp8質(zhì)粒載體中,構(gòu)建Psmp8+Luciferase+MCS質(zhì)粒

2、,并進(jìn)行酶切鑒定、基因測(cè)序證實(shí)。②利用膠原酶、鏈酶蛋白酶、DNA酶等灌注消化小鼠肝組織后,密度梯度離心法提取肝星狀細(xì)胞(HSCs);HSC培養(yǎng)傳代自行活化后,進(jìn)行針對(duì)αSMA的Westernblot及免疫熒光檢測(cè)。③Psmp8+Luciferase+MCS質(zhì)粒及海腎熒光素酶質(zhì)粒按20:1比例混合后分別轉(zhuǎn)染HSCs、小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12、小鼠庫(kù)弗細(xì)胞系RAW264.7作為實(shí)驗(yàn)組,peGFP質(zhì)粒及海腎熒光素質(zhì)粒按20:1比例混合后分別轉(zhuǎn)染

3、HSC、AML12、RAW264.7作為對(duì)照組,48h后雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法檢測(cè)兩質(zhì)粒表達(dá)情況。
　　【結(jié)果】：
　?、貾smp8+Luciferase+MCS質(zhì)粒經(jīng)酶切及基因測(cè)序鑒定正確,成功構(gòu)建了Psmp8+Luciferase質(zhì)粒。②Westernblot及免疫熒光檢測(cè)示所提取細(xì)胞培養(yǎng)傳代后可表達(dá)αSMA。③雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示Psmp8+Luciferase+MCS質(zhì)粒中螢火蟲熒光素酶基因可在活化HSCs中