腫瘤特異性啟動子調控SEA基因抗肺癌的實驗研究.pdf

1、目的： 本研究首先以紅色熒光蛋白為目的基因，比較肝癌來源的hTERT啟動子、肺癌來源的hTERT啟動子以及Survivin啟動子腫瘤特異性啟動子在肺癌A549中的啟動活性；選擇在A549肺癌細胞中有較強啟動活性的Survivin啟動子為調控序列，構建pGL-S-SEA真核表達質粒；通過RT-PCR鑒定重組質粒在A549細胞中的特異性表達；通過PBMC刺激實驗以MTT法檢測重組質粒在A549細胞中的表達產物的超抗原活性；表達產物活

2、化的PBMC的抗A549細胞活性的研究。本研究旨在為探索肺癌及其它腫瘤的靶向基因治療途徑及機理奠定基礎。 方法： 1.用PCR法和基因克隆技術在真核表達質粒pGL3-hTERT、基礎上分別構建3種啟動子調控的、以紅色熒光蛋白為目的基因的真核表達質粒pGL-H-RED、pGL-LH-RED和pGL-S-RED。 2.將該3種重組質粒分別用脂質體轉染人肺腺癌細胞(A549)和人胚肺成纖維細胞(MRC-5)，72h后在

3、熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白的表達，并用Imagepro-Plus6.0分析3種啟動子在相同時間內啟動紅色熒光蛋白的表達水平。 3.以ATCC25923金黃色葡萄球菌基因組為模板，PCR擴增sea基因。選擇在A549肺癌細胞中有較強啟動活性的Survivin啟動子為調控序列，以pGL-S-RED為基礎，由sea基因替代其“Red”基因，構建pGL-S-SEA真核表達質粒；用脂質體將該質粒轉染A549細胞，72h后提取總RNA，通

4、過RT-PCR鑒定重組質粒在A549細胞中的特異性表達。 4.用脂質體將pGL-S-SEA質粒轉染A549細胞,72h后，收集細胞培養(yǎng)的上清液和轉染細胞裂解液。制備健康獻血者PBMC，用上清液和細胞裂解液進行PBMC刺激實驗，并用MTT法、通過比較刺激指數以檢測其促細胞增殖效應。 5.制備經細胞裂解液、上清液誘導24h后的PBMC，分別將其與A549細胞共同培養(yǎng)，24h后，用MTT法、通過比較其殺傷率以檢測測其殺瘤效應。

5、 結果： 1.經限制性內切酶酶切及DNA測序證實pGL-H-RED、pGL-LH-RED和pGL-S-RED真核表達質粒構建成功；重組質粒分別轉化A549細胞和MRC-5細胞72h后，在A549細胞中觀察到了紅色熒光蛋白的表達，而在MRC-5細胞中無紅色熒光表達。經Imagepro-Plus6.0分析，pGL-S-RED熒光蛋白在A549細胞中表達最強，pGL-LH-RED次之，pGL-H-RED最弱，在A549細胞中的

6、熒光強度(IOD)分別為201.17、171.70和136.34。 2.經限制性內切酶酶切及DNA測序證實pGL-S-SEA真核表達質粒構建成功。質粒轉化A549細胞后，RT-PCR.結果表明，pGL-S-SEA質粒在A549細胞中成功表達sea目的基因，基強度為內參(GADPH gene)的65.96％。 3.經MTT實驗結果證實，pGL-S-SEA質粒轉化A549細胞的裂解液具有促進人PBMC增殖活性、上清液無明顯促

7、PBMC增殖作用，裂解液實驗組、上清液實驗組和PHA陽性對照組的刺激指數分別為1.29、0.95和1.58。 4.經MTT實驗結果證實，經pGL-S-SEA質粒轉化A549細胞裂解液誘導的PBMC，表現(xiàn)出一定的殺傷A549細胞的活性，其中裂解液實驗組和對照組的殺傷活性分別為31.965％和21.116％。 結論： 1.成功構建了3種腫瘤特異性啟動子調控的、以紅色熒光蛋白為目的基因的真核表達質粒，3種啟動子均表現(xiàn)出