人類心肌α-actin啟動子真核表達載體的構(gòu)建及在ES細胞中的初步應(yīng)用.pdf

1、心肌壞死導致心肌細胞死亡,進一步導致心衰、心肌重構(gòu)等.由于成年化的心肌細胞不能分裂,尋找可替代死亡心肌細胞的移植物來治療心肌壞死是近年來研究的熱點.胚胎干細胞具有多分化潛能,適宜條件下可分化為多種細胞,從而構(gòu)成機體的不同器官與組織.利用ES細胞的分化潛能和定向分化的可調(diào)性,將胚胎干細胞誘導分化為心肌細胞,可以作為心肌細胞移植治療的細胞來源.但是,對這種來源的心肌細胞要求很高純度,因為全能干細胞移植到個體可能會導致畸胎瘤.研究表明,通過基

2、因操作可以從分化的ES細胞中純化獲得所需的心肌細胞.α-actin是心臟發(fā)生的最早標志,在ES細胞分化為自發(fā)收縮的心肌細胞之前特異性表達,指導其組織特異性表達的是α-actin基因啟動子.對這一啟動子的研究,不僅可間接研究心肌發(fā)育過程,更重要的是可以用來做調(diào)控序列純化ES細胞源心肌細胞作移植治療.該實驗的目的旨在構(gòu)建出含人類心肌α-actin啟動子的真核表達載體,用來轉(zhuǎn)染小鼠ES細胞,純化和進一步研究ES細胞源心肌細胞.我們用PCR法直

3、接從全基因組中擴增人類心肌α-actin基因的啟動子片段,連接到pMD-18T載體上,酶切鑒定并測序.進而將這一調(diào)控區(qū)與去掉巨細胞病毒啟動子的真核表達載體pEGFP-N1(4.1kb)進行重組,獲得了真核表達載體,命名為α-actin-pEGFP-N1.將α-actin-pEGFP-N1純化后,通過脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染小鼠ES細胞,進行免疫組化染色.該研究分為兩部分:1、根據(jù)已發(fā)表的人類心肌α-actin啟動子基因的序列設(shè)計1對含有特異性酶切

4、位點的引物,并利用PCR技術(shù)進行擴增.序列分析表明,擴增片段雖然與Genbank里登陸的序列同源性僅為72%,但包含有完整的啟動子元件和轉(zhuǎn)錄專一調(diào)節(jié)因子相應(yīng)的識別序列,尤其是(AP1、SP1、TATA盒、CAAT盒、轉(zhuǎn)錄起始點等).2、嘗試用pEGFP-N1作為框架結(jié)構(gòu),獲得了含人類心肌α-actin啟動子的真核表達載體α-actin-pEGFP-N1;用純化的EGFP質(zhì)粒,在不同的條件下轉(zhuǎn)染小鼠ES細胞,摸索與優(yōu)化實驗條件.結(jié)果表明: