斑馬魚acta1啟動子的分離及其表達載體在構建轉基因熒光魚中的應用.pdf

1、我國是世界水產大國，將轉基因等現代生物技術引入傳統(tǒng)的水產養(yǎng)殖中，已成為必然的發(fā)展趨勢?，F代生物技術，在觀賞水族業(yè)中，更具應用前景。隨著組織特異性啟動子研究的深入，用熒光基因構建重組子，并轉入魚受精卵中，獲得在不同部位發(fā)熒光的轉基因觀賞魚技術已經得到初步應用。本研究所用到的單聚體綠色熒光蛋白（AcGFP）是一種新穎的報告基因，來源于水母體內藍色發(fā)光蛋白質，是EGFP熒光蛋白質的變異體。與單聚體GFP的氨基酸有94％的同源性?？稍隗w外或正在

2、發(fā)育的胚胎或成體的原位方便地進行實時觀察。 肌動蛋白（actin）是微絲的結構成分，分子量為43kD。斑馬魚的α-actin1基因位于其第17號染色體上，所調控的α-肌動蛋白1為骨骼肌所特有。本研究利用PCR技術，從斑馬魚基因組DNA中分離了斑馬魚α-肌動蛋白1（α-actin1）基因的啟動子及其上游調控序列片段（2019bp）。序列分析表明，該啟動子所在區(qū)域片段序列與NCBI網上公布的α-actin1基因5’側翼區(qū)相應序列的相

3、似性為98.7％，經進一步分析，在67位發(fā)現了100％MEF2順式調控序列元件，在47位、1078位和1636位發(fā)現了88.9％MEF2順式序列調控元件。在370位、679位以及802位發(fā)現了三個E順式序列盒調控元件，MEF2盒，E盒等都對肌肉表達起調控作用。分析還發(fā)現，在所得序列的1667位點上發(fā)現了在轉錄中起重要作用的TATA盒。根據第一個外顯子起始的所在位點，分析軟件初步確定了所得片段的1714位點的A為轉錄起始位點。 將

4、分離得到的α-actin1基因啟動子及其上游調控序列片段與AcGFP熒光基因進行重組，得到α-actin1-AcGFP重組子。通過基因導入儀，將α-actin1-AcGFP重組子導入斑馬魚受精卵細胞核中，獲得細肌絲（肌動蛋白）特異性表達的綠色熒光蛋白的轉基因斑馬魚。為確定外源基因（acta1-AcGFP）的最佳注射濃度，本實驗分別設置了100ng/ul、200ng/ul、300ng/ul、400ng/ul、500ng/ul五組不同外源D

5、NA濃度并以TE溶液為陰性對照，導入斑馬魚受精卵中，觀察熒光基因在斑馬魚仔魚中的表達。根據統(tǒng)計學分析，初步確定外源基因（α-actin1-AcGFP）的最佳注射濃度為400ng/ul，熒光表達率平均為16.0％，在表達熒光的仔魚中，有50％的魚苗熒光強表達，此時熒光魚苗畸形率為41.7％。對所得熒光魚苗分別在出膜1天、出膜10天和出膜1個月進行觀察。通過觀察，發(fā)現熒光蛋白主要在骨骼肌中表達，且表達量隨仔魚肌肉的發(fā)育呈增長趨勢。從仔魚開始

6、直到成魚，在藍光燈的照射下，綠色熒光均能通過肉眼直接觀察。證明了分離得到的α-actin1啟動子所在區(qū)域片段具有有效的驅動功能。 本實驗用不連續(xù)SDS聚丙烯酰胺膠在蛋白水平分別對1月齡和3月齡表達熒光強的斑馬魚進行了熒光蛋白定量，通過估算，初步確定獲得的1月齡和3月齡的熒光斑馬魚其熒光蛋白含量分別為1.05mg和3.5mg，分別占總體重（去內臟）的0.75％和0.83％。實驗結果表明，熒光基因蛋白在斑馬魚體內的表達是呈增長趨勢的