HBV核心區(qū)啟動子反義真核表達載體的構建.pdf

1、背景
　　 HBV感染是一個嚴重威脅到人類健康的全球性問題,HBV是引起急慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝細胞肝癌的重要致病因素?？共《局委熓悄壳奥砸倚透窝椎年P鍵性治療措施,現有的抗病毒藥物干擾素-α和核苷類似物的療效有限,基因治療日益成為目前的研究熱點之一?；蛑委煹年P鍵在于選擇良好的轉基因載體、合適的目的基因和實現目的基因的可控性表達?；蚬こ讨袘米疃嗟妮d體是真核細胞表達載體,如病毒類載體,它們能將目的基因導入宿主細胞并穩(wěn)定表

2、達。本實驗選擇真核表達載體pEGFP-C1,為在細胞水平和體內觀察其抑制HBV復制效果打下基礎,同時選擇HBV core啟動子(core promoter,cp)作為目的基因(因為該啟動子指導HBV pgRNA和pc mRNA轉錄的正確啟動),構建HBV cp的反義真核表達載體,該載體可以轉錄出cp的反義RNA,反義RNA與pgRNA中的cp部分結合有可能使pg RNA逆轉錄為負鏈DNA受阻,同時可能導致pg RNA翻譯蛋白的水平下降,

3、從而使HBV合成和包裝下降,最終有可能使HBV的復制長期受到抑制。
　　 目的
　　 HBV核心區(qū)啟動子的克隆及其反義真核表達載體的構建,為乙型肝炎的基因治療探索新的治療靶點。
　　 方法：
　　 1.提取HBV DNA:選取外周血HBV DNA載量大于106IU/ml的慢性乙型肝炎患者,用體液病毒提取試劑盒提取HBV DNA。
　　 2.PCR擴增HBV核心區(qū)啟動子序列:選取HBV全長序列中nt

4、1636-nt1860作為擴增片段(該片段包含有HBV核心區(qū)啟動子),用Taq DNA聚合酶進行PCR反應擴增HBV核心區(qū)啟動子,瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產物,初步確定引物及提取的HBV DNA模板的可實用性；用Pfu DNA聚合酶PCR擴增HBV核心區(qū)啟動子序列,以增加擴增基因的保真性,擴增產物進行載體構建。
　　 3.重組質粒pEGFP-C1-cp的構建及鑒定:將擴增的HBV核心區(qū)啟動子和真核表達載體pEGFP-C1經限

5、制性內切酶SacⅡ和HindⅢ分別酶切,用T4DNALigase連接后得到重組質粒pEGFP-C1-cp。將重組質粒pEGFP-C1-cp轉化感受態(tài)大腸桿菌(escherichia coli,E.coli)DH5α,選取陽性克隆進行PCR、酶切鑒定,鑒定后測序。
　　 結果：
　　 1.HBV核心區(qū)啟動子的PCR擴增:用Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶擴增后的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳,在225bp處有特異性條

6、帶出現。
　　 2.重組質粒pEGFP-C1-cp的鑒定:重組質粒pEGFP-C1-cp PCR反應后電泳,結果顯示在225bp處有特異性條帶出現；重組質粒pEGFP-C1-cp經SacⅡ和HindⅢ酶切后電泳,結果顯示在約225bp和4700bp處均有特異性條帶出現；重組質粒pEGFP-C1-cp中HBV核心區(qū)啟動子測序結果與GeneBank公布的序列相一致,同源性為97％。
　　 結論：
　　 本實驗成功克隆