人ELP3基因反義真核表達載體的構建及其功能研究.pdf

1、目的：組蛋白甲基化、乙酰化等表觀遺傳修飾對基因表達有重要影響。已有的研究結果表明，酵母Elongator復合物作為一個具有組蛋白乙?；D移酶活性的復合體，協(xié)助RNA聚合酶Ⅱ參與GAL1，SSA3等基因的轉錄延伸過程。已知人與酵母Elongator復合物組成高度保守，功能極為相似，其Elp3亞基均是組蛋白乙酰基轉移酶活性的核心。在體外去除HeLa細胞抽提物中的Elongator復合物可降低其轉錄染色質模板的速率，提供了人Elongator

2、復合物參與轉錄延伸的生化證據(jù)，但目前尚無人Elongator復合物與其調控的靶基因方面的報道。本論文的目的是通過構建人ELP3基因反義真核表達載體，并轉染HeLa細胞，抑制或者阻斷ELP3基因的表達，以研究ELP3基因下調對HSP70表達的影響，從而了解Elp3及其所在的復合物是否參與HSP70的轉錄調控，為深入研究Elongator復合物的催化亞基Elp3在真核基因表達調控中的功能奠定基礎，并為探索某些與轉錄相關疾病的發(fā)生機理提供有價

3、值的信息。 方法：選取人ELP3基因三個不同的區(qū)段(HAT區(qū)、非HAT區(qū)、基因全序列)構建了反義質粒pRS313ah1644、pRS314ah1107、pRS314ah450，通過轉入酵母的敏感性實驗和對ELP3及SSA3基因半定量RT-PCR檢測，篩選出抑制作用最為明顯的非HAT區(qū)1107bp片段構建了反義真核表達質粒pcDKA3ah1107，雙酶切鑒定證實人ELP3基因反義RNA真核細胞表達質粒構建成功。通過脂質體將該反義R

4、NA表達質粒轉染至HeLa細胞內(nèi)，以G418篩選陽性細胞克隆；同時以脂質體攜帶熒光蛋白表達質粒pEGFP轉染HeLa細胞，并用熒光顯微鏡觀察細胞，評估轉染效率。運用Northern blot方法檢測外源導入質粒和內(nèi)源ELP3在HeLa細胞中的表達情況；運用RT-PCR和Western blot檢測HeLa細胞中HSPTO在基因和蛋白水平的表達情況。實驗結果采用SPSS軟件作方差分析(多樣本均數(shù)的兩兩比較)。 結果：運用酵母功能互

5、補和基因表達分析實驗體系快速篩選出對人ELP3抑制作用最為明顯得非HAT區(qū)1107bp片段；用此片段構建哺乳動物細胞反義RNA表達質粒pcDNA3ah1107。脂質體攜帶質粒轉染HeLa細胞的效率約在12％左右；在G418篩選轉染轉染細胞中，運用Northern blot可檢測到導入的反義質粒和空質?？稍贖eLa細胞中穩(wěn)定表達；與空質粒轉染對照組、未轉染細胞對照組相比，反義ELP3轉染組ELP3 mRNA表達水平顯著下降(P<0.01)

6、，RT-PCR和Western Blot檢測表明，反義轉染組HSP70 mRNA和蛋白質水平也顯著下降(P<0.01)；而空質粒轉染組和未轉染細胞對照組的ELP3和HSP70 mRNA及Hsp70蛋白質水平均無顯著性差異(P>0.05)。 結論：人ELP3基因反義RNA表達質粒pcDNA3ah1107可高度抑制人ELP3基因mRNA水平的表達，進而導致HSP70 mRNA和蛋白質水平的明顯降低，也即反義質粒下調HeLa細胞ELP