皮秒脈沖電場抗宮頸癌移植瘤血管生成效應及機制的實驗研究.pdf

1、近年來，世界范圍內都致力于發(fā)現(xiàn)新的惡性腫瘤治療策略，作為一種新興的腫瘤生物學治療方法，脈沖電場(pulsed electric fields, PEF)逐漸被人們所重視。根據(jù)脈寬的不同，脈沖電場又分為毫秒脈沖電場、微秒脈沖電場、納秒脈沖電場以及皮秒脈沖電場。目前對毫秒、微秒和納秒級脈沖電場的研究已取得了較大進展：基于微秒級脈沖電場可逆性電穿孔現(xiàn)象的電化學療法是繼手術、放療和化療之后治療惡性腫瘤的一種新的有效方法；納秒級脈沖電場引起的一系

2、列稱為細胞內處理效應的細胞反應，在腫瘤的治療中也展現(xiàn)出了較好的前景。然而，微秒及納秒脈沖電場需要采用電極陣列穿刺至腫瘤組織才能將電場傳輸至腫瘤內部，因此在一定程度上限制了它們的臨床應用。
　　皮秒脈沖電場通過沖激脈沖輻射天線無創(chuàng)地將脈沖電場傳輸至生物組織內部，能有效的殺傷腫瘤細胞，并且能避免對腫瘤組織周邊正常組織的損傷，從而實現(xiàn)腫瘤的無創(chuàng)治療。因此，皮秒脈沖電場匹配超寬帶的沖激脈沖輻射天線以其優(yōu)異的特性在生物醫(yī)學治療領域引起了人們

3、極大的興趣。
　　由于新生血管在腫瘤的生長、浸潤和轉移方面發(fā)揮著重要作用，因此抑制腫瘤血管生成，阻斷腫瘤營養(yǎng)供應，是抗腫瘤血管生成治療的主要理論基礎。然而，目前研究者們在這方面的研究主要集中在微秒和納秒脈沖電場，其中Cemazar等發(fā)現(xiàn)微秒脈沖電場可以直接損傷血管內皮細胞，導致血流中斷，增強對腫瘤的毒性作用；Chen等用納秒脈沖作用于小鼠肝細胞癌，發(fā)現(xiàn)VEGF表達降低，MVD降低。據(jù)查新，還沒有皮秒脈沖電場對腫瘤血管生成影響的實驗

4、研究。
　　在惡性腫瘤中，因宮頸癌從早期的癌前病變發(fā)展到真正的惡性病變存在一個較長的“窗口期”（數(shù)年至十余年不等），因此被稱為“善良的惡性腫瘤”。這一較長的“窗口期”為皮秒脈沖電場治療提供了一個非常合適的時機。因此本課題以BALB/c裸鼠為人宮頸癌移植瘤動物模型的載體，從組織水平深入研究皮秒脈沖電場抗宮頸癌移植瘤血管生成效應及機制，從而完善皮秒脈沖電場用于腫瘤治療的相關研究。
　　第一部分皮秒脈沖電場對宮頸癌移植瘤的殺傷效應

5、及抗血管生成效應
　　第一節(jié)宮頸癌動物模型的構建
　　目的：構建宮頸癌移植瘤動物模型。
　　方法：將制備好的人宮頸癌HeLa細胞懸液0.2ml（5×106/ml）接種于裸鼠右下肢大腿根部皮下。當腫瘤直徑長至0.8-1.0cm的時候，取下腫瘤并將其切成1.5×1.5cm3的小塊，迅速接種于待接種裸鼠皮下，以構建人宮頸癌移植瘤模型。約三周左右移植瘤直徑可達1.0cm。
　　結果：成功構建人宮頸癌移植瘤動物模型。

6、>　　第二節(jié)皮秒脈沖電場對宮頸癌移植瘤的殺傷效應
　　目的：離體觀察皮秒脈沖電場對宮頸癌移植瘤的作用
　　方法：將人宮頸癌移植瘤裸鼠隨機分為四個組：對照組（無任何處理）、50kV/cm處理組、60kV/cm處理組和70kV/cm處理組。其中，三個實驗組其它參數(shù)固定如下：脈寬800ps，頻率3Hz，脈沖個數(shù)2000個。皮秒脈沖電場處理后一周取下腫瘤進行組織切片。分別采用HE染色和透射電子顯微鏡觀察腫瘤組織的大體變化及腫瘤細胞、

7、血管內皮細胞超微結構的變化。
　　結果：皮秒脈沖電場處理后一周，實驗組腫瘤組織壞死面積隨著皮秒脈沖電場強度的增加而增大，壞死程度也逐漸加重；電鏡下，實驗組腫瘤細胞內內質網(wǎng)和線粒體隨電場強度的增加呈現(xiàn)不同程度的腫脹和擴張，同時細胞間連接逐漸減少，70kV/cm處理組，腫瘤細胞及血管內皮細胞幾乎無法辨別。
　　結論：皮秒脈沖電場對宮頸癌移植瘤腫瘤細胞和血管內皮細胞具有明顯的殺傷效應。
　　第三節(jié)皮秒脈沖電場對宮頸癌移植瘤血

8、管生成的影響
　　目的：在體和離體觀察皮秒脈沖電場對宮頸癌移植瘤血管生成的影響。
　　方法：實驗分組及皮秒脈沖電場處理方法同前。于皮秒脈沖電場處理前和處理后一周，通過裸鼠尾靜脈注射光聲造影劑ICG，采用光聲成像技術在體觀察移植瘤組織內的血管變化情況；光聲成像后取下移植瘤進行組織切片，免疫組化染色體外觀察腫瘤組織內血管的變化情況。
　　結果：與對照組相比，實驗組腫瘤組織內血管的光聲信號隨著電場強度的增加而逐漸減弱，其中以

9、60kV/cm和70kV/cm處理組下降最為明顯；免疫組化結果表明：實驗組腫瘤組織內微血管密度隨著電場強度的增強逐漸下降，同樣以60kV/cm和70kV/cm處理組下降最為明顯。
　　結論：皮秒脈沖電場具有抗宮頸癌移植瘤血管生成的效應。
　　第二部分皮秒脈沖電場抗宮頸癌移植瘤血管生成效應的機制
　　目的：研究皮秒脈沖電場抗宮頸癌移植瘤血管生成效應的機制。
　　方法：實驗分組及皮秒脈沖處理方法同前。于皮秒脈沖電場處

10、理前和處理后一周，采用光聲成像技術在體觀察移植瘤內血氧飽和度的變化情況。光聲成像后取下腫瘤組織進行組織切片，免疫組化染色觀察腫瘤內血管生成相關因子HIF1α和VEGF的組織表達情況；WB和PCR從翻譯和轉錄水平檢測上述因子的蛋白和基因表達情況。
　　結果：與對照組相比，實驗組移植瘤內血氧飽和度隨著皮秒脈沖電場強度的增加逐漸下降，以60kV/cm和70kV/cm處理組下降最為明顯。同時，免疫組化結果顯示，隨著皮秒脈沖電場強度的增大，