PB3A對人宮頸癌SiHa和大腸癌HT29細胞增殖抑制作用研究.pdf

1、蜂膠黃酮具有抗癌活性，它的提取物Pinobanksin-3-acetate（PB3A）可以抑制HCT116、SW480、jurkat、A549、HepG-2、Hela、MDA-MB-231、EC-109、SGC-7901等細胞的增殖并誘導它們的凋亡，但PB3A對宮頸癌細胞SiHa和大腸癌細胞HT29是否有增殖抑制作用尚未清楚。本研究檢測PB3A對SiHa和HT29細胞的增殖抑制與誘導凋亡的作用及其分子機制，旨在找出PB3A對這兩個細胞作

2、用強度的異同點，為PB3A的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。
　　在前期研究中，我們用100μg/mL PB3A處理大腸癌SW480細胞，對此進行了人類全基因組表達譜芯片技術篩查分析，發(fā)現(xiàn)了差異表達基因（ HSPA6、C3ORF63、HMOX1、DNAJA4、SNAI2、KLHL20），并驗證了芯片結果的真實性。本研究中用40μg/mL PB3A干預宮頸癌SiHa細胞24h，用實時熒光定量PCR技術對候選基因mRNA的表達量進行檢測，證明P

3、B3A是否改變候選基因的表達水平，并與前期研究進行結合對比PB3A對SW480和SiHa細胞中候選基因表達水平的影響是否一致。本論文工作包括以下兩個部分：
　　1.蜂膠黃酮PB3A對SiHa和HT29細胞的增殖抑制作用
　　本研究的目的是檢測PB3A對宮頸癌SiHa和大腸癌HT29細胞的增殖抑制及誘導凋亡作用，比較它們對PB3A的敏感性，探討PB3A的抗腫瘤作用。體外培養(yǎng)SiHa和HT29細胞，在倒置顯微鏡下觀察不同濃度（1

4、0、20、30、40μg/mL） PB3A作用前后各細胞株的形態(tài)學變化。應用MTT法繪制細胞生長曲線，不同濃度（10、20、30、40μg/mL）PB3A不同時間（24、48、72h）對SiHa和HT29細胞作用后，檢測OD值、計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。利用流式細胞儀檢測不同濃度PB3A（20、30和40μg/mL PB3A和15μg/mL順鉑）誘導的兩個細胞株的凋亡率。結果在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞體積縮小、皺縮、細

5、胞從梭性變?yōu)閳A形，出現(xiàn)核固縮，胞質(zhì)混濁，培養(yǎng)液中出現(xiàn)較多的懸浮細胞，這種特點隨PB3A濃度的增加和干預時間的延長越來越明顯。MTT法檢測發(fā)現(xiàn)PB3A在體外可顯著抑制SiHa和HT29細胞的增殖，PB3A作用SiHa細胞24h、48h、72h時的IC50值分別為40.84μg/mL、15.24μg/mL、13.98μg/mL，PB3A作用HT29細胞24h、48h、72h時的IC50值分別為74.12μg/mL、64.77μg/mL、43

6、.87μg/mL。40μg/mL PB3A對SiHa細胞的抑制作用高于對HT29的抑制作用，并與作用時間和劑量呈正相關。20μg/mL、30μg/mL和40μg/mL PB3A均可誘導SiHa和HT29細胞的凋亡。最高濃度（40μg/mL）PB3A誘導的SiHa和HT29細胞早期凋亡率分別為23.45％和20.8%，其中SiHa的凋亡率高于HT29的凋亡率。PB3A對SiHa和HT29細胞的誘導凋亡作用呈劑量依賴性。
　　2.用實

7、時熒光定量PCR法檢測SiHa細胞中候選基因的表達
　　在前期研究中的芯片結果顯示，用100μg/mL PB3A處理SW480細胞24h后，細胞中HSPA6、C3ORF63、HMOX1、DNAJA4、SNAI2等基因均上調(diào)表達（ΔCt比較，P<0.01），驗證結果與芯片結果一致；而KLHL20的表達差異沒有統(tǒng)計學意義（ΔCt比較，P>0.05）。
　　本實驗用40μg/mL PB3A干預SiHa細胞24h后，用Trinzol

8、試劑抽提細胞總RNA，將總RNA逆轉錄為cDNA。以β-actin做內(nèi)對照。用實時熒光定量PCR檢測各基因的表達情況。實驗結果以mean士SD表示。以SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件對PB3A干預組與未干預組基因的ΔCt值分別進行兩獨立樣本的t檢驗(雙側)分析。結果顯示，與對照組相比，PB3A干預組中SNAI2基因下調(diào)表達（差異倍數(shù)為0.15，ΔCt比較，P<0.01），該趨勢與前期結果不一致；KLHL20和HSPA6上調(diào)表達，差異倍數(shù)分別