易于血管化生物支架的構(gòu)建及其修復骨與軟組織缺損的性能評估.pdf

1、糖尿病會對人體骨代謝產(chǎn)生影響，導致I型糖尿病患者骨質(zhì)疏松，并增加I/II糖尿病患者骨折機率，造成骨折后延遲愈合、不愈合及假關(guān)節(jié)的出現(xiàn)。同時，糖尿病患者開放性骨折后經(jīng)常面臨皮膚創(chuàng)面，尤其是足部創(chuàng)面難以愈合并最終形成糖尿病潰瘍的風險，這是最常見也是最嚴重的糖尿病并發(fā)癥之一。隨著中國每年糖尿病患者數(shù)量的快速增加，皮膚軟組織及骨組織缺損的病例亦是逐年遞增，而如何讓創(chuàng)面及骨組織能夠快速愈合并恢復正常成為臨床上的棘手問題。因此，急需一種安全、有效、

2、易于推廣的方法來促進愈合并阻止晚期嚴重并發(fā)癥的發(fā)生。目前，主流觀點認為缺損區(qū)域周邊的血管病變及新生血管減少是導致缺損難愈合的最重要的局部原因之一。隨著對于糖尿病患者血管病變機理研究的深入，目前認為低氧誘導因子信號通路（hypoxia inducible factor-1α/HIF-1α）的失調(diào)在該病理進程中起著至關(guān)重要的作用。去鐵胺(desferrioxamine/DFO)是一種能夠在常氧條件下激活 HIF-1α信號通路的化合物，稱為“

3、低氧模擬化合物”。因此低氧模擬化合物可能對糖尿病患者骨與軟組織缺損修復具有潛在作用。目前，靜電紡絲及水凝膠等新型材料技術(shù)制備的支架是藥物的優(yōu)良載體，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物定點、定量及可控緩釋。如何將低氧模擬化合物與生物材料有機結(jié)合并應(yīng)用于骨與軟組織修復，值得我們進行深入有益的探索。
　　目的：
　　構(gòu)建負載低氧模擬化合物的新型支架材料，通過體內(nèi)、體外實驗驗證其易于血管化的作用并闡述其分子機制及細胞信號通路。
　　方法：
　

4、　1.腹腔注射鏈脲霉素（streptozotocin/STZ）誘導I型糖尿病SD大鼠（type1 diabetes mellitus sprague dawley rat/T1DM SD rat），與同周齡正常大鼠進行對比，通過Micro-CT、三點彎曲力學試驗驗證其骨質(zhì)疏松存在，并通過Western blot證實高血糖環(huán)境中HIF-1α通路受損。利用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建負載DFO的PCL（polycaprolactone）管狀纖維支架，通

5、過掃描電鏡觀察支架材料微觀結(jié)構(gòu)。體外選用小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（murine bone marrow stem cells/mBMSCs）驗證載藥材料的生物相容性，并利用Realtime-PCR技術(shù)檢測該細胞在支架釋放藥物干預(yù)下相關(guān)成血管及成骨mRNA表達情況；選用人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cell/HUVEC）檢驗材料成管特性。體內(nèi)試驗中，構(gòu)建T1DM大鼠股骨遠端骨缺損模型，通過

6、Micro-CT、X-ray、組織形態(tài)學等方法評價DFO對糖尿病骨質(zhì)疏松性骨缺損修復的作用。
　　2.構(gòu)建攜載DFO的親水性PVA（polyvinyl alcohol）- CS（chitosan）復合靜電紡絲纖維膜，通過掃描電鏡、FTIR（fourier transform infrared spectroscopy）光譜儀等方法檢測材料表征及藥物緩釋效果，隨后驗證其生物特性。體外選用人皮膚原代成纖維細胞（human dermal

7、 fibroblast/HFB）驗證載藥材料的生物相容性并檢測HIF-1α等相關(guān)成血管蛋白表達情況；選用HUVEC檢驗材料成管特性。體內(nèi)試驗中，在T1DM大鼠背部構(gòu)建全層皮膚缺損；利用組織形態(tài)學、Realtime-PCR、Western blot等方法評價創(chuàng)面愈合速度及質(zhì)量，同時闡明HIF-1α信號通路變化。
　　3.通過物理共混方法將DFO與可注射光交聯(lián)Gelma（gelatin methacrylamide）水凝膠相結(jié)合，構(gòu)建

8、復合載藥支架材料。通過掃描電鏡觀察支架微觀表征及藥物分布情況。利用紫外分光光度計檢測藥物緩釋效果。體外選用HFB及HUVEC檢驗支架生物相容性及相關(guān)蛋白表達情況。體內(nèi)通過構(gòu)建T1DM大鼠背部全層皮損模型，利用組織形態(tài)學實驗驗證水凝膠支架材料修復效果。
　　結(jié)果：
　　1. T1DM大鼠存在明顯的骨質(zhì)疏松，HIF-1α信號通路受損。負載DFO的PCL管狀纖維支架具有良好的生物相容性并能夠上調(diào) mBMSCs內(nèi)成血管相關(guān)的vegf

9、以及成骨相關(guān)的runx-2、osteocalcin的mRNA的高表達，并能有效誘導HUVEC成管；DFO干預(yù)組大鼠股骨遠端骨缺損處的骨密度、骨量、血管含量較對照組明顯升高；骨骼中HIF-1α、RUNX-2蛋白表達要高于對照組，成骨活躍，愈合速度加快。
　　2.攜載DFO的親水性PVA- CS復合靜電紡絲纖維支架擁有優(yōu)秀的吸水和機械性能，微觀纖維結(jié)構(gòu)能夠有效促進HFB粘附、增殖，細胞內(nèi)HIF-1α、VEGF等成血管相關(guān)蛋白表達量均高

10、于對照組。同時可以促進 HUVEC有效成管；在體內(nèi)，纖維支架材料具有與創(chuàng)面愈合進程相匹配的降解速度及藥物釋放速度，可以快速募集成血管相關(guān)細胞及因子進入損傷區(qū)域，并能夠加強HFB及HUVEC兩種細胞的協(xié)同作用，生成血管、促進表皮再生、加速I/III型膠原轉(zhuǎn)化，最終修復創(chuàng)面。
　　3.負載DFO的光交聯(lián)Gelma水凝膠支架材料具有良好的生物相容性，形態(tài)可塑且不受創(chuàng)面大小、深淺限制，能夠為細胞長入、增殖、分化提供相對封閉穩(wěn)定的3D微環(huán)境