Transwell間接共培養(yǎng)條件下成骨細(xì)胞向脂肪細(xì)胞橫向分化的實驗研究.pdf

1、目的:探討在Transwell間接共培養(yǎng)體系條件下，將成熟脂肪細(xì)胞作為誘導(dǎo)因素，觀察成骨細(xì)胞成脂橫向分化的可能性，為下一步進行體內(nèi)實驗和進一步臨床治療提供參考。
　　方法:1．將3T3-L1小鼠成纖維樣前體細(xì)胞傳至3代，選取對數(shù)期的細(xì)胞加入成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)10d，用油紅O染色鑒定其為成熟脂肪細(xì)胞后，將成熟脂肪細(xì)胞作為誘導(dǎo)因素來誘導(dǎo)成骨細(xì)胞。傳代至第3代的MC3T3-E1小鼠成骨樣細(xì)胞設(shè)立為實驗組。選取上室下室面積之比為1:4，插入式

2、Transwell培養(yǎng)板，將實驗組細(xì)胞和小鼠成熟脂肪細(xì)胞組細(xì)胞分別種于Transwell體系的上室和下室，并記為0d，對照組為用低糖DMEM單獨培養(yǎng)的MC3T3-E1小鼠成骨樣細(xì)胞。2．油紅O染色實驗檢驗實驗組和對照組7d、14d、21d3個時間點的脂滴染色情況；3．茜素紅染色檢驗實驗組和對照組細(xì)胞在7d、14d、21d3個時間點鈣化結(jié)節(jié)量的表達(dá)情況；4．以脂肪條件培養(yǎng)基（FCCM）培養(yǎng)基及低糖 DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)小鼠成骨樣細(xì)胞，以

3、MTT法在0h、24h、36h3個時間點檢測實驗組與對照組的細(xì)胞增殖抑制率；5．檢測實驗組和對照組細(xì)胞在7d、14d、21d3個時間點甘油三酯（TG）相對含量表達(dá)；6．Western blot檢測各組細(xì)胞在7d、14d、21d3個時間點成脂目的蛋白PPARγ2的表達(dá)含量。7．?dāng)?shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS19.0軟件分析，使用方差分析進行組內(nèi)及組間的差異性比較、分析，以α=0.05作為檢驗標(biāo)準(zhǔn)，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，P<0.05表示

4、差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:1．鏡下觀察結(jié)果：成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)10d，前體脂肪細(xì)胞的形態(tài)由成纖維樣變?yōu)閳A形，胞質(zhì)內(nèi)脂滴聚集，經(jīng)油紅O染色后，鑒定為成熟脂肪細(xì)胞；實驗組細(xì)胞共培養(yǎng)7d細(xì)胞呈長梭形，細(xì)胞內(nèi)未見脂滴，14d時細(xì)胞呈成纖維樣，胞質(zhì)內(nèi)逐漸出現(xiàn)黑色顆粒物質(zhì)及少量脂滴，培養(yǎng)至21d，部分細(xì)胞由成纖維樣變?yōu)闄E圓形或圓形，胞質(zhì)內(nèi)脂滴增多；對照組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)容及細(xì)胞形態(tài)未有明顯改變；
　　2．油紅O實驗結(jié)果顯示實驗組細(xì)胞染色區(qū)呈遞增

5、趨勢，對照組細(xì)胞染色區(qū)無明顯變化；
　　3．茜素紅染色結(jié)果顯示實驗組細(xì)胞自7d、14d、21d呈鈣結(jié)節(jié)量表達(dá)減少的趨勢；對照組細(xì)胞在3個時間點則無明顯變化，呈大片著色區(qū)；
　　4．MTT法檢測結(jié)果顯示：實驗組抑制率分別為0h組(0.1947±0.09)％、24h組(64.917±2.4)%、36h組(71±2.3)%，對照組抑制率為0h組(0.1735±0.05)%、24h組(23.33±3.4)%、36h組(56.33±1

6、)%，實驗組與對照組相比及實驗組組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），對照組組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；
　　5．TG相對含量檢測結(jié)果顯示實驗組細(xì)胞甘油三酯聚集量呈遞增趨勢，隨時間的增長而增多，實驗組TG表達(dá)量為7d組(0.20167±0.015)、14d組(0.25167±0.024)、21d組(0.58167±0.023)，對照組的表達(dá)量為7d組(0.22±0.027)、14d組(0.19667±0.025)

7、、21d組(0.24±0.042)，在3個時間點實驗組組間相比及實驗組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意（P<0.05），對照組組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；
　　6．Western blot實驗結(jié)果顯示：實驗組細(xì)胞PPARγ2蛋白表達(dá)量在3個時間點呈遞增趨勢，實驗組目的蛋白表達(dá)量為7d組(0.245±0.012)、14d組(0.40817±0.0365)、21d組(0.759±0.039)，對照組的表達(dá)量為7d組(0.2781±

8、0.043)、14d組(0.2955±0.022)、21d組(0.3849±0.03)，而成熟脂肪細(xì)胞的目的蛋白表達(dá)量為7d組(0.9905±0.32)、14d組(1.1259±0.65)、21d組(0.98999±0.25)，實驗組組間相比，實驗組與成熟脂肪細(xì)胞組相比，以及實驗組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論:1．在Transwell間接共培養(yǎng)體系中，成骨細(xì)胞在成熟脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)下呈現(xiàn)出成脂橫向分化趨