共培養(yǎng)條件下脂肪細(xì)胞脂毒性對成骨細(xì)胞影響的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著人民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)及生活作息不良所導(dǎo)致的肥胖、骨質(zhì)疏松等亞健康狀態(tài)日趨嚴(yán)重，II型糖尿病、胰島素抵抗等疾病的發(fā)病率亦呈逐年升高的趨勢，且患者一旦患病往往需要終生服藥，影響生活質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)在這些病理條件下，人體內(nèi)會產(chǎn)生大量脂肪組織，在骨髓腔中也可觀察到大量脂肪細(xì)胞蓄積，使髓腔呈現(xiàn)黃色。脂肪細(xì)胞在髓腔中的蓄積會抑制成骨細(xì)胞增殖、分化和功能，對骨組織的代謝產(chǎn)生非常嚴(yán)重的影響。雖然成骨細(xì)胞增殖分化相關(guān)的重要

2、分子序貫發(fā)生的框架已經(jīng)建立完成，但是脂肪細(xì)胞對成骨細(xì)胞產(chǎn)生脂毒性的具體分子生物學(xué)機制卻仍未明確。
　　游離脂肪酸（Free fatty acids，F(xiàn)FAs）可以對多種細(xì)胞的活性起到抑制作用。脂肪細(xì)胞通過脂解作用，將胞內(nèi)的脂滴分解成游離脂肪酸，在大部分情況下，游離脂肪酸含量的異常升高會通過線粒體脂肪酸β氧化作用產(chǎn)生大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），而活性氧的產(chǎn)生又可以進一步激活下游信號通路級聯(lián)

3、反應(yīng)，從而對細(xì)胞凋亡、增殖、分化產(chǎn)生影響。因此游離脂肪酸的含量將直接影響細(xì)胞的生物學(xué)活性。
　　地塞米松是一個廣泛應(yīng)用于臨床的糖皮質(zhì)激素類藥物，長期大劑量使用會導(dǎo)致嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松甚至骨壞死，文獻報道地塞米松可以促進脂肪細(xì)胞脂解作用從而增加游離脂肪酸的含量。二甲雙胍可以延緩胃腸道對葡萄糖的吸收速率，提高胰島素的敏感性，抑制肝的糖異生。對于非胰島素依賴性糖尿病有非常好的治療效果，同時可以降低體脂含量。研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以抑制脂肪細(xì)胞脂

4、解從而減少游離脂肪酸的含量。
　　MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是存在于細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶。在大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)均檢測到MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該信號通路在將細(xì)胞外刺激級聯(lián)傳遞至細(xì)胞及核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)如增殖、分化、凋亡等的過程中具有至關(guān)重要的作用。MAPKs信號通路在骨形成過程中起到關(guān)鍵的作用，但由于所處上游可以干擾幾乎與骨形成所有相關(guān)的

5、分子通路（如Ihh-PTHrP、BMP、Wnt-β-catenin、EGF、FGF），因此在不同外界因素的刺激下可導(dǎo)致促進或抑制骨形成兩種截然不同的結(jié)果出現(xiàn)。ROS可以激活細(xì)胞內(nèi) MAPKs信號通路。
　　研究目的：
　　①探討脂肪細(xì)胞對成骨細(xì)胞增殖、分化的影響，建立脂肪細(xì)胞/成骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系；探索不同濃度地塞米松、二甲雙胍對成骨細(xì)胞增殖、分化，脂肪細(xì)胞成脂、分化的影響，為后期實驗選擇合適劑量濃度；
　?、诜治龉才囵B(yǎng)

6、體系中氧化應(yīng)激水平的變化，探討氧化應(yīng)激水平與游離脂肪酸兩者間的關(guān)系；游離脂肪酸含量測定以及地塞米松、二甲雙胍對游離脂肪酸含量的影響；
　?、厶接懝才囵B(yǎng)體系下對成骨細(xì)胞生物學(xué)活性影響的主要分子機制。
　　方法與結(jié)果：
　?、偈紫冉⒊芍?xì)胞、成骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系，為后期實驗建立合適的實驗?zāi)Ｐ汀＿x用3T3-L1小鼠前成脂細(xì)胞系和MC3T3-E1小鼠前成骨細(xì)胞系，兩細(xì)胞系分別進行成脂誘導(dǎo)和成骨誘導(dǎo)12天后，通過 qRT-PCR

7、分別對成脂相關(guān)基因 PPAR-γ、Adiponectin、FABP以及成骨相關(guān)基因RunX2、Col A1、osteocalcin進行測定，并行染色學(xué)鑒定確定兩細(xì)胞系均已分化為成熟的脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞，用于共培養(yǎng)及后續(xù)實驗。
　　②在共培養(yǎng)體系下測定成骨細(xì)胞增殖及分化能力的改變。發(fā)現(xiàn)Adipocyte/Osteoblast（AD/OB）共培養(yǎng)組，成骨細(xì)胞凋亡較對照組明顯增加，且在早期AD/OB組較OB/OB組細(xì)胞增殖能力受到抑制，

8、后期AD/OB組成骨能力也明顯減弱。提示脂肪細(xì)胞可以抑制成骨細(xì)胞的生物學(xué)活性。
　?、圻M一步研究發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)體系 AD/OB組 FFAs較 OB/OB組有明顯增加，PAI-1、MCP-1、leptin、adiponectin、IL-6含量較OB/OB組變化不明顯，無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　④地塞米松、二甲雙胍可以分別作用于脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞，對兩細(xì)胞的增殖及分化產(chǎn)生影響，且存在劑量依賴關(guān)系。共培養(yǎng)體系下發(fā)現(xiàn)FFAs含量可以受到地塞

9、米松和二甲雙胍的影響，地塞米松可以促進 FFAs含量的升高，二甲雙胍可以抑制FFAs生成，且均存在劑量依賴關(guān)系。同時兩藥物還對 PAI-1、MCP-1、leptin、adiponectin、IL-6含量起到一定影響，但無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　⑤在共培養(yǎng)體系中分別加入FFAs、地塞米松、二甲雙胍，通過改變FFAs含量發(fā)現(xiàn)對MC3T3-E1凋亡、增殖及成骨分化能力有明顯影響。提示FFAs在脂肪細(xì)胞對成骨細(xì)胞的影響中扮演重要角色。
　

10、?、逓榱朔治龉才囵B(yǎng)體系下氧化應(yīng)激水平的變化，檢測MDA、SOD活性、GSH-Px活性、ROS含量，發(fā)現(xiàn)AD/OB組抗氧化水平明顯降低，而ROS含量明顯增高。單純添加FFAs、地塞米松后可以提高ROS含量，而二甲雙胍可以降低ROS的含量。添加ROS抑制劑NAC后，可以改善AD/OB組成骨細(xì)胞增殖及成骨分化能力?？紤]是由于FFAs提高成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，從而進一步影響其細(xì)胞活性。
　?、?Wester blot檢測發(fā)現(xiàn)，AD/OB組

11、Akt、Erk、P38磷酸化水平明顯升高，在分別添加FFAs和地塞米松后將進一步提高Akt、Erk、P38磷酸化水平，而加入二甲雙胍后可以抑制三者磷酸化水平的升高，并可以抑制地塞米松的作用。這一結(jié)果表明FFAs可以通過Akt、Erk、P38信號通路的改變來影響成骨細(xì)胞活性。
　?、嗤ㄟ^應(yīng)用LY294002（Akt信號通路抑制劑）、SB203580（P38信號通路抑制劑）、PD98059(Erk信號通路抑制劑)發(fā)現(xiàn)，抑制Erk和P3

12、8信號通路可以明顯降低共培養(yǎng)體系下脂肪細(xì)胞抑制成骨細(xì)胞增殖、分化的毒性作用。共培養(yǎng)體系中加入NAC后，觀察到Akt、Erk、P38磷酸化水平發(fā)生明顯的抑制。提示脂肪細(xì)胞在AD/OB共培養(yǎng)體系下是通過FFAs-ROS-P38/Erk通路對成骨細(xì)胞增殖、分化起到抑制作用。
　　研究結(jié)論：
　　通過本課題的研究，我們發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系下脂肪細(xì)胞對成骨細(xì)胞凋亡、增殖、分化起抑制作用，闡明了該過程的分子機制，明確了FFAs-ROS-Erk