種植體微納米形貌對成骨細胞行為影響的分子機制研究.pdf

1、純鈦表面微納米形貌能夠很好地模擬人體骨組織和細胞外微環(huán)境的結構,因此可能具有更好成骨細胞生物學效應,但材料形貌對細胞調控的具體分子機制尚不清楚。本研究采用酸蝕和陽極氧化的方法,在純鈦表面構建微納米形貌,以人成骨肉瘤細胞系 MG63為研究對象,全面系統(tǒng)評價了微納米形貌對成骨細胞生物學行為的影響,并采用分子生物學方法,深入研究參與材料形貌調控細胞行為的信號通路途經,以闡明骨植入材料的表面形貌對骨組織形成的影響的分子生物學機制。本研究的方法及

2、結果不僅為骨植入材料的表面結構的優(yōu)化設計及基因修飾提供依據以達到提高骨植入材料的骨結合效率的目的,而且將為探明其它材料表面因素如表面化學成分或其它骨植入材料與細胞及組織相互作用的分子機制研究提供參考,從而更加全面指導骨植入材料的表面設計。
　　第一部分純鈦表面微納米形貌的制備
　　【目的】采用課題組前期實驗中已建立的純鈦表面微納米形貌的制備方案,制備含有不同管徑TiO2納米管的微納米復合梯度形貌,為后續(xù)的實驗提供研究模型。<

3、br>　　【方法】將純鈦試樣拋光至鏡面,采用5％的氫氟酸酸蝕試樣30min,試樣超聲清洗后,采用穩(wěn)壓直流陽極氧化電源在5V和20V兩個電壓下分別對試樣進行陽極氧化處理1h,采用場發(fā)射掃描電鏡觀察試樣表面形貌。
　　【結果】純鈦表面經酸蝕和陽極氧化處理后形成微米坑表面復合不同管徑TiO2納米管的微納米復合結構。TiO2納米管管徑的大小與陽極氧化電壓成正比,5V和20V電壓下分別形成管徑約為30nm和100nm的納米管陣列。
　

4、　【結論】酸蝕和陽極氧化方法能夠在純鈦表面形成微米坑復合不同管徑TiO2納米管的微納米形貌。
　　第二部分微納米形貌對成骨細胞生物學行為的影響
　　【目的】評價微納米形貌對成骨細胞生物學行為的影響。
　　【方法】將人骨肉瘤細胞系 MG63細胞接種于材料表面,采用掃描電鏡觀察試樣表面細胞的伸展形態(tài),MTT方法觀察細胞增殖水平,實時定量PCR方法檢測細胞在材料表面成骨相關基因的表達水平,采用天狼星紅染色觀察試樣表面成骨細胞

5、的膠原分泌能力,采用茜蘇紅染色觀察材料表面成骨細胞的細胞外基質礦化能力。
　　【結果】成骨細胞MG63在微納米表面充分伸展,細胞隨著TiO2納米管管徑的增大而呈現逐漸伸長的形態(tài)。微納米形貌對細胞的增殖沒有顯著性影響,在30nm管徑納米管表面,增殖能力稍有下降。微納米形貌顯著上調了細胞成骨相關基因的表達水平,促進了成骨細胞的膠原分泌能力和細胞外基質礦化能力,并且這種促進作用在含有100nm納米管的微納米形貌表面更加明顯。
　　

6、【結論】微納米形貌能夠促進成骨細胞 MG63的成骨分化功能,含有大管徑納米管(100nm)的微納米形貌對成骨分化的促進作用更加明顯。
　　第三部分微納米形貌表面Wnt/b-catenin信號通路對成骨細胞的影響
　　【目的】檢測 Wnt/b-catenin信號通路是否參與材料對細胞行為的影響,評價Wnt/b-catenin信號通路在微納米形貌調控成骨細胞功能中的作用。
　　【方法】將 MG63細胞接種于材料表面,采用實

7、時定量 PCR方法檢測試樣表面MG63細胞中Wnt信號通路中受體、激活因子和抑制因子的表達水平,采用Western blot檢測細胞核內b-catenin水平;將外源性Wnt信號通路激活劑Wnt3a和抑制劑Dkk1分別加入到細胞培養(yǎng)液中,隨后采用Western blot檢測細胞核內b-catenin水平,并采用實時定量PCR方法檢測試樣表面成骨相關基因的表達水平,采用商業(yè)試劑盒檢測成骨細胞堿性磷酸酶表達水平,采用天狼星紅染色檢測成骨細胞

8、膠原分泌能力的變化,采用MTT方法檢測細胞增殖能力,采用流式細胞術檢測細胞凋亡的變化。
　　【結果】微納米形貌上調了Wnt信號通路受體--低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)和Wnt信號通路激活劑Wnt3a的表達,下調了Wnt通路抑制因子Dkk1/2和分泌型卷曲蛋白相關蛋白1/2(sFRP1/2)的表達,Wnt/b-catenin信號在微納米形貌表面被激活。在光滑表面加入外源性Wnt信號激活劑Wnt3a上調Wnt/b-catenin

9、信號活性后,成骨分化相關指標如:成骨基因的表達、堿性磷酸酶水平和膠原分泌能力都隨之增高。在微納米形貌表面加入外源性 Wnt信號抑制劑 Dkk1后,微納米表面原本增高的Wnt/b-catenin活性受到明顯的抑制,成骨分化相關指標的表達水平也隨之受到明顯的抑制。材料表面改變Wnt/b-catenin信號活性后對細胞增殖和凋亡沒有明顯的影響。
　　【結論】微納米形貌通過調控Wnt信號通路中Wnt因子的表達,激活Wnt/b-cateni

10、n信號活性,被激活的Wnt/b-catenin信號促進了成骨細胞在微納米形貌表面的成骨分化。
　　第四部分微納米形貌表面ILK/b-catenin信號通路對成骨細胞的影響
　　【目的】檢測整合素連接酶/b-catenin(ILK/b-catenin)信號通路在微納米形貌調控成骨細胞生物學行為過程中的作用。
　　【方法】將MG63細胞接種于試樣表面,采用實時定量PCR方法檢測b-catenin、ILK、整合素b1和b3亞

11、基的表達水平,采用western blot方法檢測胞漿和胞核內b-catenin、胞漿內磷酸化糖原合成激酶3b(p-GSK3b)和 ILK的表達水平;采用小干擾 RNA轉染方法沉默 ILK的表達后,檢測試樣表面細胞成骨基因表達水平的改變、膠原分泌能力和細胞外基質礦化水平的變化,并再一次采用western blot檢測胞漿和胞核內b-catenin、胞漿內GSK3b和p-GSK3b表達水平的變化。
　　【結果】微納米形貌促進了整合素

12、b1和b3亞基和ILK的表達。在微納米表面高表達的ILK一方面通過促進b-catenin mRNA的表達,另一方面通過磷酸化GSK3b進而抑制b-catenin在胞漿內的降解,兩方面共同作用激活了b-catenin信號活性。采用小干擾RNA下調ILK表達后,微納米形貌表面的成骨相關基因的表達水平、膠原分泌能力和細胞外基質礦化水平也隨之顯著下降。
　　【結論】ILK/b-catenin信號通路參與調控微納米形貌對成骨分化功能的影響。

13、
　　第五部分微納米形貌表面ILK/ERK1/2信號通路對成骨細胞的影響
　　【目的】檢測整合素連接酶/細胞外調節(jié)蛋白激酶1/2(ILK/ERK1/2)信號通路在微納米形貌調控成骨細胞生物學行為過程中的作用。
　　【方法】將 MG63細胞接種到材料表面,采用 western blot方法檢測試樣表面總ERK1/2、磷酸化ERK1/2和ILK的表達水平;采用小干擾RNA轉染的方法沉默ILK表達后,再次采用western

14、blot檢測試樣表面總ERK1/2和磷酸化ERK1/2表達水平的變化。將ERK1/2信號通路抑制劑U0126加入到細胞培養(yǎng)液中處理細胞后,采用MTT方法檢測試樣表面細胞增殖能力的變化,采用實時定量PCR方法檢測細胞成骨分化相關基因表達水平的變化,采用商業(yè)試劑盒染色檢測成骨細胞堿性磷酸酶分泌水平的變化,采用天狼星紅染色檢測細胞膠原分泌能力的變化,采用茜蘇紅染色檢測成骨細胞細胞外基質礦化水平的變化。
　　【結果】微納米形貌顯著性上調了