幾種常見(jiàn)多酚類(lèi)化合物對(duì)低壓低氧環(huán)境下大鼠記憶能力保護(hù)效應(yīng)及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:高原低壓低氧環(huán)境對(duì)快速進(jìn)入高原的人的認(rèn)知功能，如短時(shí)記憶、注意廣度及注意轉(zhuǎn)化能力、思維判斷能力均產(chǎn)生不利影響，進(jìn)而影響人正常的生活、工作和學(xué)習(xí)。隨著高原地區(qū)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，進(jìn)入高原地區(qū)人數(shù)逐年增加，這種影響的危害性越來(lái)越顯著。此外，從軍事角度來(lái)看，未來(lái)戰(zhàn)爭(zhēng)快速推進(jìn)及跨區(qū)戰(zhàn)略投送呈常態(tài)化，認(rèn)知功能受損導(dǎo)致的軍事作業(yè)能力下降將極大地削弱戰(zhàn)斗力。目前針對(duì)急進(jìn)高原初期認(rèn)知功能障礙的防治措施主要有兩類(lèi):階梯適應(yīng)性訓(xùn)練和化學(xué)合成藥物（如乙酰唑

2、胺）干預(yù)，適應(yīng)性訓(xùn)練需要特定條件且耗時(shí)長(zhǎng)，化學(xué)合成藥物干預(yù)的安全有效的作用劑量范圍較窄且難以祛除有害作用。而研究發(fā)現(xiàn)廣泛存在于自然界的植物化學(xué)物有著多種生物化學(xué)功能，能發(fā)揮有效的抗氧化應(yīng)激、抗炎等作用，且較少產(chǎn)生副作用。因此，開(kāi)展可減輕急進(jìn)高原初期認(rèn)知功能障礙、促進(jìn)高原認(rèn)知功能快速適應(yīng)的天然植物化學(xué)物的研究，提供及時(shí)的、有效的生物醫(yī)學(xué)解決方案，有著較大的現(xiàn)實(shí)意義。
　　記憶能力在諸多認(rèn)知功能中占重要地位。雖然低壓低氧環(huán)境下機(jī)體發(fā)生

3、記憶能力損傷的機(jī)制尚不明確，但活性氧產(chǎn)生增多導(dǎo)致的氧化應(yīng)激水平過(guò)高在低壓低氧環(huán)境下記憶能力損傷的發(fā)生中占重要地位，作為活性氧主要產(chǎn)生部位的線粒體和易受氧化應(yīng)激損傷的神經(jīng)元突觸亦參與其中。如何保護(hù)低壓低氧環(huán)境下的線粒體和神經(jīng)元突觸是減輕記憶能力損傷的一個(gè)重要作用靶點(diǎn)。越來(lái)越多的研究證據(jù)顯示，植物化學(xué)物具多種生物化學(xué)功能，其中多酚類(lèi)化合物更是受到較多關(guān)注和研究，能夠發(fā)揮有效的抗氧化應(yīng)激作用。此外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多酚類(lèi)化合物可發(fā)揮對(duì)腦缺血再灌注損

4、傷中神經(jīng)元的保護(hù)作用，且可改善病理狀況下線粒體的狀態(tài)。低壓低氧導(dǎo)致的機(jī)體損傷變化，與缺血再灌注導(dǎo)致的損害改變相類(lèi)似。基于以上分析，我們推測(cè)，以多酚類(lèi)化合物調(diào)節(jié)神經(jīng)元線粒體穩(wěn)態(tài)及改善神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)來(lái)減少低壓低氧環(huán)境下神經(jīng)元的損傷，可能會(huì)成為減輕低壓低氧環(huán)境下機(jī)體記憶能力損傷的一條有效途徑。
　　本研究擬利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，從動(dòng)物和細(xì)胞水平研究對(duì)低壓低氧環(huán)境下機(jī)體認(rèn)知記憶能力損傷具有保護(hù)效應(yīng)的多酚類(lèi)化合物及其作用機(jī)制。

5、在模擬高原低壓低氧環(huán)境中建立大鼠記憶能力損傷模型，并在此動(dòng)物模型基礎(chǔ)上檢測(cè)四種常見(jiàn)多酚類(lèi)化合物-白藜蘆醇(Resveratrol，RSV)、槲皮素(Quercetin，QUE)、二氫楊梅素(Dihydromyricetin，DHM)和楊梅素(Myricetin，MYR)對(duì)大鼠記憶能力損傷的作用，發(fā)現(xiàn)QUE和DHM能明顯減輕大鼠記憶能力損傷;圍繞QUE和DHM發(fā)揮作用的靶點(diǎn)和機(jī)制，探索了線粒體穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)改變和相關(guān)信號(hào)蛋白表達(dá)水平

6、在其中發(fā)生的變化，并闡明SIRT3/FOXO3信號(hào)通路在DHM保護(hù)低壓低氧環(huán)境下大鼠記憶能力的作用。
　　方法:本研究采用低壓氧艙模擬海拔5000m低壓低氧環(huán)境，雄性SD大鼠暴露于低壓低氧環(huán)境下1、3、7、14d后利用Morris水迷宮檢測(cè)不同暴露時(shí)長(zhǎng)后大鼠空間記憶能力的變化，比較分析后選擇7d為暴露時(shí)長(zhǎng)建立低壓低氧環(huán)境下大鼠記憶能力損傷模型，并以此模型為基礎(chǔ)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。RSV、QUE、DHM和MYR四種常見(jiàn)多酚類(lèi)化合物分別以

7、梯度劑量(50、75、100mg/kg.bw/d)灌胃暴露于低壓低氧環(huán)境下的大鼠，7d后利用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠空間記憶能力的變化，發(fā)現(xiàn)100mg//kg.bw/d劑量的QUE(QUE100)和100mg/kg.bw/d劑量的DHM(DHM100)對(duì)低壓低氧環(huán)境下大鼠記憶能力具有顯著的保護(hù)作用。
　　結(jié)果:1.大鼠分別暴露于模擬海拔5000m低壓低氧環(huán)境中1、3、7、14d，Morris水迷宮檢測(cè)大鼠空間記憶能力后發(fā)現(xiàn)與常氧

8、對(duì)照組大鼠相比，7d和14d的暴露使得大鼠空間記憶能力顯著下降;且暴露14d后大鼠空間記憶能力下降程度與暴露7d后的大鼠相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此選擇7d作為建立低壓低氧下大鼠記憶損傷模型的暴露時(shí)長(zhǎng)。
　　2.大鼠暴露于低壓低氧環(huán)境下時(shí)(7d)，四種多酚類(lèi)化合物:RSV、QUE、DHM和MYR分別以梯度劑量(50、75、100mg/kg.bw/day)灌胃干預(yù)大鼠7d，并在低壓低氧暴露結(jié)束后利用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠空間記憶能力

9、，發(fā)現(xiàn)與低氧對(duì)照組相比，QUE100和DHM100均可明顯減輕大鼠的記憶能力損傷。而Morris水迷宮測(cè)試沒(méi)有觀察到RSV和MYR各劑量干預(yù)組大鼠記憶能力損傷與低氧對(duì)照組大鼠相比有明顯減輕。
　　3.TEM觀測(cè)結(jié)果顯示QUE100和DHM100均能顯著改善低壓低氧導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元中線粒體結(jié)構(gòu)異常和突觸后致密物減少;Qrt-PCR結(jié)果顯示，與低氧對(duì)照組相比，QUE100和DHM100均使大鼠海馬神經(jīng)元線粒體DNA相對(duì)拷貝數(shù)明顯增加;

10、基于酶聯(lián)免疫技術(shù)的微孔板檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與低氧對(duì)照組相比，QUE100大鼠海馬組織線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ活性明顯升高，DHM100干預(yù)組大鼠海馬組織線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ活性顯著升高;蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，QUE100干預(yù)組大鼠海馬組織PGC-1α、SIRT1蛋白、線粒體生成相關(guān)蛋白Nrf1、TFAM及線粒體融合相關(guān)蛋白Mfn1、Mfn2表達(dá)水平顯著高于低氧對(duì)照組，而QUE100大鼠海馬組織線粒體分裂相關(guān)蛋白Fis1、Dr

11、p1表達(dá)水平顯著低于低氧對(duì)照組;此外QUE100大鼠海馬組織神經(jīng)生長(zhǎng)因子BDNF和FNDC5蛋白表達(dá)水平明顯高于低氧對(duì)照組。脂質(zhì)過(guò)氧化物水平檢測(cè)顯示DHM100干預(yù)組大鼠海馬組織MDA水平顯著低于低氧對(duì)照組。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，DHM100干預(yù)組大鼠海馬組織SIRT3蛋白表達(dá)水平明顯高于低氧對(duì)照組，而FOXO3乙?；矫黠@低于低氧對(duì)照組。此外，DHM100干預(yù)組大鼠海馬神經(jīng)元線粒體生成相關(guān)蛋白PGC-1α、TFAM和神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋

12、白SYP、PSD95表達(dá)水平顯著高于低氧對(duì)照組。
　　4.低氧環(huán)境下培養(yǎng)HT-22細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)DHM干預(yù)減輕了低氧導(dǎo)致的HT-22細(xì)胞線粒體DNA相對(duì)拷貝數(shù)下降，增強(qiáng)了HT-22細(xì)胞線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性并增加了HT-22細(xì)胞ATP水平，降低了HT-22細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化水平、細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和線粒體超氧化物水平，能上調(diào)SIRT3蛋白表達(dá)水平，同時(shí)降低FOXO3乙?；?，可上調(diào)線粒體生成相關(guān)蛋白PGC-1α、TFAM和突觸

13、相關(guān)蛋白SYP、PSD95表達(dá)水平。采用SIRT3 siRNA轉(zhuǎn)染HT-22細(xì)胞沉默SIRT3蛋白表達(dá)后，沒(méi)有觀察到DHM對(duì)低氧環(huán)境下培養(yǎng)的HT-22細(xì)胞的FOXO3乙?；降挠绊?。采用SIRT3 siRNA或FOXO3 siRNA轉(zhuǎn)染HT-22細(xì)胞沉默SIRT3或FOXO3蛋白表達(dá)后，沒(méi)有觀察到DHM對(duì)低氧環(huán)境下培養(yǎng)的HT-22細(xì)胞線粒體DNA的相對(duì)拷貝數(shù)、線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性、HT-22細(xì)胞ATP水平、HT-22細(xì)胞

14、脂質(zhì)過(guò)氧化水平、細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和線粒體超氧化物水平及線粒體生成相關(guān)蛋白PGC-1α、TFAM和突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD95表達(dá)水平的顯著影響。
　　結(jié)論:1.成功建立模擬高原低壓低氧環(huán)境下大鼠記憶能力損傷模型，發(fā)現(xiàn)在模擬海拔5000m低壓低氧環(huán)境下暴露7d后大鼠空間記憶能力受到明顯損傷。
　　2.比較研究四種常見(jiàn)多酚類(lèi)化合物對(duì)低壓低氧環(huán)境下大鼠記憶能力的保護(hù)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)QUE和DHM均可明顯減輕低壓低氧環(huán)境下大鼠記憶能力的

15、損傷，而RSV和MYR對(duì)低壓低氧環(huán)境下大鼠記憶能力的損傷無(wú)顯著性保護(hù)作用。
　　3.QUE和DHM均可以有效改善低壓低氧環(huán)境下大鼠海馬神經(jīng)元線粒體生成、結(jié)構(gòu)和功能，并能顯著減輕海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)損傷。
　　4.QUE能有效調(diào)節(jié)低壓低氧環(huán)境下大鼠海馬神經(jīng)元線粒體的融合分裂相關(guān)蛋白表達(dá)水平并能促進(jìn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF表達(dá)水平。SIRT1/PGC-1α/Nrf1/Tfam通路參與了QUE對(duì)線粒體穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用，PGC-1α/

16、FNDC5/BDNF參與了QUE對(duì)神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用。
　　5.利用HT-22細(xì)胞低氧損傷模型和siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，發(fā)現(xiàn)DHM可通過(guò)SIRT3去乙酰化FOXO3進(jìn)而調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)，包括有效改善線粒體生成、結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)顯著降低線粒體超氧化物水平、細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和氧化應(yīng)激水平，保護(hù)突觸結(jié)構(gòu)，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元功能的作用。
　　綜上所述，本課題研究了四種常見(jiàn)多酚類(lèi)化合物對(duì)急進(jìn)高原初期機(jī)體記憶能力損傷的保護(hù)適應(yīng)及其分子機(jī)